3D-eksplantnaya kul'tura spinal'nogo gangliya myshi kak model' dlya issledovaniy neyrotrofinov v regenerativnoy meditsine

Abstract

Full Text

Нейротрофины играют ключевую роль в развитии, дифференцировке, выживаемости нейронов и регенерации нервов. В настоящем исследовании, используя 3D модель эксплантной культуры спинальных ганглиев (СГ) мышей GFP-nestin в Матригеле, мы сравнили влияние нейротрофинов NGF, BDNF и GDNF на рост аксонов и миграцию GFP-nestin клеток из СГ. Мыши GFP-nestin, у которых нейральные предшественники экспрессируют нестин и зеленый флуоресцентный белок GFP под одним промоте-ром, были любезно предоставлены нам Г. Ениколоповым (Grigori N. Enikolopov, Renaissance School of Medicine, Stony Brook University, NY). Разработанный нами метод является удобной моделью для оценки влияния растворимых факторов и терапевтических агентов на рост и регенерацию нервов в R&D исследованиях. Анализируя экспланты в течение 21 дня, можно оценить скорость роста и миграцию клеток из эксплантов в Матригель. Спинальные ганглии GFP-nestin мышей высаживали в каплю Матригеля, в который дополнительно добавляли нейротрофины, и культивировали 14 дней. Используя иммунофлуорес-центное окрашивание эксплантов (whole 3D mount assay) и конфокальную микроскопию (Leica SP) для трехмерной визуализации, оценивали количество аксонов и число мигрировавших GFP-nestin клеток. Аксоны красили антителами к NF200, ядра клеток докрашивали DAPI. Было обнаружено, что GDNF достоверно стимулирует рост аксонов (в 2 раза, p<0,05) из СГ, но не BDNF и NGF, по сравнению с контролем. Известно, что регенерация аксонов стимулируется также за счёт активных глиальных клеток, которые выполняют трофическую функцию для регенерирующих нервов, поэтому далее мы анализировали число GFP-nestin клеток, мигрировавших из СГ в Матригель. Обнаружено, что NGF и GDNF, но не BDNF, значительно стимулируют миграцию GFP-nestin клеток по сравнению с контролем (p<0,05). Результаты позволяют сделать вывод о том, что наибольшей способностью стимулировать регенерацию аксонов обладает GDNF, так как именно он стимулирует не только рост аксонов, но и миграцию глиальных клеток. Эффект NGF хоть и выражен в стимуляции миграции глиальных клеток, тем не менее, оказывается недостаточным на регенерации аксонов.