Method of endoscopic preparation of a brain biopsy and isolation of neural stem cells from it for autotransplantation

Full Text

Получение достаточного количества неиммуногенных нейральных клеток является актуальной проблемой клинической нейротрансплантации. Для замещения нефункционирующих нервных клеток или стимуляции нейрогенеза in situ в клинической нейротрансплантации нужны специализированные нервные клетки или прогениторы с потенциалом к росту и дифференцировке в нейрональном направлении. Наиболее распространёнными источниками такого клеточного материала в клинике является головной мозг абортированных эмбрионов [или плодов] человека [1, 3] и собственные нейрональные клетки пациента, выделенные из обонятельной зоны слизистой оболочки носа [olfactory ensheathing cells] [2]. В качестве альтернативного источника клеточного материала рассматриваются аллогенные нейрональные стволовые клетки [ИСК] головного мозга трупов. ИСК были выделены из различных отделов головного мозга [включая кору, субвентрикулярную зону, сетчатку, гиппокамп и обонятельную зону] трупов в разное время после смерти до 140 часов и охарактеризованы [4-6]. Однако, использование этих источников ИСК имеет те или иные ограничения или недостатки - малое количество клеток [фетальный мозг и аутогенный материал], проблема инфекционной безопасности [фетальный и трупный аллогенный материал], проблема онкогенной безопасности [эмбриональные стволовые клетки и их дериваты, ранние взрослые стволовые клетки] и иммунологический конфликт [аллогенный и ксеногенный материал]. Таким образом, поиск оптимального источника клеточного материала для заместительной клинической нейротрансплантации остаётся актуальной задачей. Если бы проблема достаточного количества клеточного материала была решена, то «источником выбора» могли бы стать аутогенные ИСК.

Исследователи из шведского Karolinska Institute предлагают новый метод выделения и экспансии аутогенных НСК из биоптатов головного мозга неврологических пациентов. Методика была испытана на 13 больных, результаты опубликованы в недавнем номере журнала Neurosurgery. Метод выделения ИСК из биоптатов головного мозга человека и получения из них нейронов был разработан группой 2 года назад [7]. Цели настоящего исследования - показать выполнимость, безопасность и низкую инвазивность процедуры на пациентах, а также возможность выделения и экспансии ех vivo достаточного количества ИСК.

Микробиоптаты получали эндоскопически из боковых желудочков головного мозга во время рутинного нейрохирургического вмешательства по поводу гидроцефалии. Осложнений процедуры, включая «новый» неврологический дефицит, не наблюдали. Клеточная суспензия, выделенная из биоптатов механически-ферментативным методом, помещалась в дифференцировочную среду. Клетки всех биоптатов формировали нейросферы в течение нескольких дней и создавали новые нейросферы после диссоциации и пассирования в течение 3-7 недель. Стволовые клетки нейросфер клонировались [около 7% всех клеток нейросферы] и были способны дать новую нейросферу в 2 пассажах. То есть, если считать, что одна нейросфера содержит в среднем ЗОО клеток, и из одной клетки можно получить 1 нейросферу, то в двух пассажах можно выделить 90 000 клеток из одной исходной. В конце первой недели культивирования 78% клеток несли глиальные маркёры и 22% - нейрональные.

Функциональная зрелость нейронов, подтверждённая методом патч-кламп, наблюдалась через 3 недели культивирования.

Таким образом, исследователи предложили новый метод выделения ауто-НСК из головного мозга пациента, показали его безопасность и выполнимость. Важным моментом является возможность производить экспансию in vitro собственных нейрональных прогениторов с получением большого количества функционально зрелых нейронов. Для выращивания нейросфер использовали протокол Johansson [8], предложенный в 1999 году. Общее количество функциональных нейрональных клеток, которое позволяет получать метод, можно считать достаточным, поскольку ранее было показано, что, например, для замещения функции при болезни Паркинсона может быть достаточно всего лишь 80 000 полноценных нейронов [1]. Локализация ИСК в субвентрикулярной зоне головного мозга человека позволяет безопасно забирать биоптат через стенку желудочка, поскольку рядом нет никаких функционально значимых структур, в отличие от другого сайта ИСК - гиппокампа и зубчатой извилины.

Чёткая анатомическая локализация сайтов ИСК в головном мозге взрослого человека, безопасность процедуры получения биоптата и возможность «наращивания» нейрональных клеток ex vivo позволят развивать этот метод в будущем и занять передовые позиции в клинической заместительной нейротрансплантологии.

About the authors

A. V. Bersenev

Author for correspondence.
Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation

References

Supplementary files