Gennaya terapiya khronicheskoy ishemii zadnikh konechnostey u krys

Abstract

Full Text

На модели хронической ишемии задней конечности крысы изучены эффекты инъекции аденовирусов, несущих гены сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF 165), глиального нейротрофического фактора (GDNF) и ангиогенина (ANG). Спустя 14 суток после создания ишемии путем иссечения фрагмента бедренной артерии крысы были разделены на 4 группы: (1) группа с введением гена ANG (Ad5-ANG, n=10; 2x1010 вирусных частиц в 60 мкл NaCl) в 4 точки дистальной части икроножной мышцы, по 15 мкл в каждую точку; (2) группа с введением комбинации генов VEGF и ANG (Ad5-VEGF+Ad5-ANG, n=10) в том же объеме в те же точки; (3) группа с введением комбинации генов VEGF, ANG, GDNF (Ad5-VEGF+Ad5-ANG+Ad5-GDNF, n=10); (4) группа контроля с введением физиологического раствора (NaCl, n=10). Для оценки экспрессии гена зеленого флуоресцентного белка (EGFP) были дополнительно прооперированы 5 животных с введением на 14 сутки после операции в дистальную часть икроножной мышцы Ad5-EGFP. Забор биоматериала осуществляли на 14 и 28 сутки после проведения генной терапии. Для идентификации кровеносных сосудов и оценки состояния мышечной ткани осуществляли иммуногистохимическую реакция с антителами против CD 31, морфометрический анализ мышечных волокон и подсчет мышечных трубочек с центрально расположенными ядрами (МЦЯ). Для оценки экспрессии терапевтических генов и специфических белков выполняли ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) и вестерн-блоттинг (WB). На 28 сутки после введения генов количество МЦЯ в области ишемии мышцы, а также количество CD31-иммунопозитивных клеток в группе Ad5-VEGF+Ad5-ANG+Ad5-GDNF было увеличено в 38.7 и 1.3 раза соответственно. Методом ПЦР-РВ на 14 сутки показано увеличение мРНК GDNF, VEGF и ANG как в группе Ad5-VEGF+Ad5-ANG, так и в группе Ad5-VEGF+Ad5-ANG+Ad5-GDNF, также отмечено увеличение экспрессии мРНК desmin в области ишемии мышц в этих группах. Методом вестерн-блотта было показано увеличение экспрессии CD34 и фактора фон Виллебранда (VWF) на 14 сутки после инъекции Ad5-VEGF+Ad5-ANG+Ad5-GDNF при сравнении с контрольной группой. Введение комбинации Ad5-VEGF+Ad5-ANG+Ad5-GDNF стимулирует регенерацию мышц, увеличивая количество МЦЯ, а также увеличивает количество сосудов. Исходя из вышеприведенных данных, ангиогенный и регенераторный потенциал генетической конструкции Ad5-VEGF+Ad5-ANG+Ad5-GDNF требует дальнейших исследования для возможности его применения в клинических целях в качестве средства, стимулирующего ангиогенез и регенерацию скелетной мышцы при ишемии.