Sravnitel'nyy analiz sposobnosti razlichnykh liniy indutsirovannykh plyuripotentnykh stvolovykh kletok differentsirovat'sya v neyral'nom napravlenii

Abstract

Full Text

На сегодняшний день технология получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) является весьма перспективной для применения в клинической практике, поскольку позволяет исключить использование фетального материала, а также проблемы, связанные с наработкой биоматериалов. Постоянное совершенствование методов получения ИПСК и направленный отбор клонов приведет к более широкому применению производных плюрипотент-ных клеток для создания терапевтических препаратов и тканеинженерных конструкций. Целью работы является получение ИПСК методом репрограммирования фибробластов человека и отбор перспективных клонов для дальнейшей дифференциров-ки в нейральном направлении. Материала и методы. Для получения ИПСК из фи-бробластов от двух доноров использовали коммерческий набор для репрограммирования «CTS CytoTune-iPS 2.1 Sendai Reprogramming Kit» на основе вируса Сендай. Все полученные линии были охарактеризованы по экспрессии маркеров плюрипотентности иммуноцитохими-ческим методом, а также с помощью ПЦР-анализа. Для подтверждения способности полученных клонов ИПСК человека к дифференцировке in vitro был проведен тест на спонтанное формирование трех зародышевых листков. Дифференцировку в нейральном направлении проводили с помощью малых молекул SB431542, 2 мкМ дорсоморфина и 200 нМ LDN193189 в течение 14 суток. Количество дифференцированных клеток определяли по маркеру нейроэпителия PAX6 с помощью проточной цитометрии. В результате отбора были получены стабильные линии ИПСК - VII_MAK_C, VI_MAK_A, V_MAK_F от первого донора, которые подтвердили свой плюрипотентный статус посредством экспрессии генов-маркеров Oct4, Sox2, Nanog, TRA-1-81 как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции, а также способность к спонтанному формированию три зародышевых листка, и имели нормальный кариотип. На следующем этапе была выбрана линия - VII_ MAK_C, которая после дифференцировки состояла на 98,4±0,6% из нейральных стволовых клеток (PAX6+). В то время как в линиях VI_MAK_A и V_MAK_F количество PAX6+ - клеток составляло 46,6±10,16% и 52,4±4,56%, соответственно. Таким образом было показано, что полученные клоны ИПСК обладают разной способностью к нейральной дифференцировке. Анализ гетерогенности культур по экспрессии PAX6+ клеток позволит выбрать линии с наибольшим терапевтическим потенциалом.