Vliyanie kriokonservatsii na adgeziyu i differentsirovku keratinotsitov v epidermal'nom ekvivalente kozhi

Abstract

Full Text

Эпидермальные эквиваленты кожи (ЭЭК) используют в регенеративной медицине для лечения ожоговых больных. Криохранение культур кератиноцитов позволяет планировать хирургические вмешательства и накапливать материал для последующих операций. Однако при этом возникает проблема сохранения жизнеспособности и пролиферативной активности в культуре кератино-цитов человека, прошедшей стадию криохранения. Цель работы: разработка способа хранения компонентов ЭЭК (первичной культуры кератиноцитов человека) с длительным сохранением жизнеспособности, про-лиферативной и метаболической активности. Задачи исследования: разработка протокола хранения компонентов ЭЭК при отрицательных температурах и исследование влияния криоконсервации на культуры кератиноцитов, в том числе на селекцию низкодифференцированных клеток. Криоконсервацию кератиноцитов проводили на программном замораживателе Planer 550/16. Эффективность протокола замораживания оценивали по жизнеспособности клеток, способности к адгезии и метаболической активности культуры кератиноцитов. Анализ экспрессии генов адгезии и дифференцировки в кератиноцитах до и после криоконсервации проводили методом RT-PCR (ламинин V, коллаген IV, лорикрин, инво-люкрин, интегрин а6р4). Наличие маркеров дифференцированных кератиноцитов до и после заморозки оценивали при помощи проточной цитометрии (СК14 и инволюкрин). Разработан состав криосреды на основе культуральных сред Cnt07, DKSFM и DMEM/F12. Был выбран оптимальный протокол замораживания кератиноцитов: скорость замораживания составляла 1°С в мин. у в интервале температур от +4°С до - 30°С. Показано, что после замораживания снижается количество клеток, экспрессирующих CK1 4 и инволюкрин. При этом процент кератиноцитов, интенсивно экспрессирующих интегрин а6, увеличивается в 3 раза, а экспрессия генов внеклеточного матрикса (коллаген IV, ламинин V) уменьшается, таким образом можно говорить о селекции низкодифференцированных клеток. Культуры клеток, прошедшие стадию криохранения, показали повышенную в сравнении с первичными культурами адгезию к биосинтетической матрице, высокую пролиферативную активность и рост в составе ЭЭК в течение 10 суток. Работа выполнена в рамках ПНИЭР по теме «Разработка технологии производства, хранения и применения биомедицинских клеточных продуктов для лечения ран» в соответствии с Соглашением о предоставлении субсидии с Минобрнауки России № 14.610.21.0012, Уникальный идентификатор работ RFMEFI61017X0012.