Molekulyarno-geneticheskie mekhanizmy regulyatsii funktsional'noy aktivnosti MMSK in vitro pri fiziologicheskoy gipoksii

Abstract

Full Text

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) - один из наиболее востребованных и давно применяемых в регенеративной медицине инструментов клеточной терапии. Тем не менее, их биология до сих пор активно изучается. Ранее нами было показано, что снижение содержания О2 в среде роста клеток in vitro до физиологических 5% с одновременным внесением фактора роста bFGF приводит к повышению про-лиферативной активности и жизнеспособности ММСК с сохранением их мультипотентности. Кроме того, было обнаружено, что добавленный в ростовую среду bFGF активирует на фоне физиологической гипоксии различные синтетические процессы, стабилизируя метаболизм ММСК и способствуя адаптации клеток к низким концентрациям кислорода. Установлено, что адаптационные реакции ММСК на низкие концентрации О2 связаны с ги-поксией-индуцируемым фактором HIF1 и белком транспортером порфириновых пигментов ABCG2. Целью работы явилось изучение влияния 5% О2 и фактора bFGF на уровень метилирования ДНК промоторов генов Hif1-a и Abcg2 в ММСК. Клетки получали из жировой ткани человека (с информированного согласия пациентов) и культивировали до 2 пассажа в стандартных условиях (5% С02, 21% 02, 37°С) в питательной среде а-МЕМ с 10% фетальной бычьей сыворотки, на 3 пассаже ММСК помещали в гипокси-ческие условия (5% С02, 5% 02, 90% N2 37°С) и культивировали в питательной среде того же состава в течение 3 сут. Для исследования экспрессии генов белков HIF1-a и ABCG2 использовали ПЦР в реальном времени, для определения уровня метилирования ДНК - метод бисульфитного секвенирования. Выявлено, что при 5% 02 экспрессия генов кислород-зависимой а-субъединицы белка HIF1 и белка ABCG2 повышается, в т. ч. за счет снижения уровня метилирования ДНК их промоторных участков. При этом уровень метилирования регулируется и внесением в ростовую среду bFGF. Независимо от содержания 02 в среде bFGF снижает уровень метилирования ДНК промоторов генов Hif1-a, Abcg2, что приводит к повышению их экспрессии. Полученные данные свидетельствуют о важной роли метилирования ДНК в определении функциональной активности ММСК в условиях культуры при физиологической гипоксии и в присутствии фактора bFGF.