Geneticheskaya korrektsiya neonatal'nogo sakharnogo diabeta dlya sozdaniya modeli izucheniya zabolevaniya

Abstract

Full Text

Дефекты гена инсулина (INS) являются одной из причин возникновения сахарного диабета у детей первого года жизни (неонатальный сахарный диабет). Мутации, приводящие к гиперинсулинемии, как правило, гетерозиготны. Причины возникновения абсолютного дефицита инсулина при гетерозиготной мутации до сих пор не ясны. Несмотря на наличие одного нормального ал-леля гена инсулина, заболевание проявляется не просто сниженным уровнем инсулина в крови, а его абсолютным дефицитом. Результаты малочисленных работ по изучению последствий мутаций гена INS, проведенных в основном на мышах и клеток линии НЕК293, противоречивы и не всегда отражают процессы патогенеза в поджелудочной железе человека. Понимание причин и механизмов развития заболевания поможет выбрать оптимальный подход для прогноза и терапии заболевания. Для создания модели заболевания мы получили индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) путём репрограммирования фибробластов кожи пациента с диагнозом неонатальный диабет с гетерозиготной мутацией c.188-31 G>A в гене инсулина (INS). Полученные ИПСК были охарактеризованы на маркеры плюрипотентности, возможности дифференцироваться в клетки трёх зародышевых листков и наличие мутации. Далее, применяя технологию геномного редактирования с использованием CRISPR-Cas9, в полученных ИПСК была исправлена гетерозиготная мутация в гене инсулина, и получена система двух изогенных линий: с мутацией и без. Клеточные линии были дифференцированы в энтодермальном направлении с целью получения инсулин-продуцирующих клеток поджелудочной железы. Полученные клетки экспрессировали маркеры предшественников клеток поджелудочной железы PDX1, NKX6.1, NEUROG3, а также инсулин и глюкагон. В дальнейшем планируется отработка протокола дифференцировки и получение зрелых инсулин-продуци-рующих р-клеток и подтверждение исправления мутации на уровне РНК и белка в полученной изогенной системе, что позволит изучить механизм патогенеза заболевания на молекулярном и клеточном уровне, и разработать фармакологические или клеточные подходы по персонализированной терапии моногенного сахарного диабета.