Sozdanie reporternogo lentivirusnogo vektora LeGO-REX1 -EGFP dlya otbora indutsirovannykh plyuripotentnykh stvolovykh kletok

Abstract

Full Text

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) используются для моделирования заболеваний и изучения роли генов. Обычно отбор колоний ИПСК идет по морфологии и не все линии клеток плю-рипотентны. Мы поставили задачу разработать метод для быстрого и простого выявления клеток, не обладающих плюрипотентностью: использование репортерного вектора на основе лентивируса, кодирующего EGFP под контролем промотора гена-маркера плюрипотентности, REX1 . Для первичного выявления плюрипотентных клеток достаточно обработать несколько колоний лентиви-русами и через два дня определить, есть ли свечение EGFP. Преимущества использования лентивирусов: 1) простота обработки клеток и анализа; 2) доставка генетического материала практически во все клетки; 3) трансдукция клеток различных видов млекопитающих; 4) замолкание лентивирусных трансгенов в плюрипотент-ных клетках. Иммуноцитохимический анализ на гены-маркеры Oct4, Sox2 и Nanog имеет недостатки: экспрессия Oct4 и Sox2 в ИПСК может быть экзогенной, а Nanog практически не экспрессируется в ИПСК Американской норки. Rex1 - маркер плюрипотентности не только ИПСК человека, но и других видов млекопитающих. Использование промотора REX1 для контроля экспрессии EGFP позволит быстро элиминировать не плюрипотентные клетки. Для создания репортерного вектора мы использовали промотор REX1 из плазмиды phREX1-Luc (Addgene, 17222) и вектор LeGO-G2 (Addgene, 25917). Плазмиду phREX1-Luc гидролизовали эндонуклеазами рестрикции Bglll, CciN и Xbal, затем выделили из агарозного геля фрагмент, содержащий промотор. Полученный фрагмент лиги-ровали с вектором LeGO-G2, гидролизованным по сайтам рестрикции CciN и BamHI. В результате мы получили плазмиду LeGO-REX1-EGFP, несущую ген EGFP под контролем промотора гена REX1 и содержащую компоненты, необходимые для сборки псевдотипированных лентивирусов. Мы показали, что трансфекция клеток Phoenix (HEK293) и эмбриональных стволовых клеток мыши DGES1 плазмидой LeGO-REX1-EGFP приводит к ожидаемой экспрессии EGFP с промотора CMV. Следующий этап тестирования ре-портерного вектора - трансдукция лентивирусами плюри-потентных клеток различных видов млекопитающих. Использованы линии клеток ЦКП «Коллекции плю-рипотентных культур клеток человека и млекопитающих общебиологического и биомедицинского направления» ИЦиГ СО РАН (http://www.biores.cytogen.ru/brc_cells/ collections/ICG_SB_RAS_CELL; http://ckp.icgen.ru/cells/).