Primenenie spektroskopii kombinatsionnogo rasseivaniya dlya izucheniya trekhmernykh kletochnykh i beskletochnykh konstruktsiy

Abstract

Full Text

В современных подходах тканевой инженерии всё чаще используют культивирование в формате 3D, позволяющее сохранять для клеток in vitro специфическое микроокружение, необходимое для поддержания базовых функций, таких как жизнеспособность, пролиферация и дифференцировочный потенциал. Примерами 3D культивирования являются эксплантные культуры, клеточные пласты, сфероиды и децеллюляризированный матрикс тканей и органов. Однако, отслеживание состояния каждой отдельной клетки в такой системе остаётся сложной задачей, связанной с рядом проблем, например, с возможностью анализа нативного образца без применения каких-либо специальных реагентов и меток. Одним из перспективных решений такой задачи является применение спектроскопии комбинационного рассеивания (КР), или Рамановской спектроскопии, зарекомендовавшей себя как метод, позволяющий без использования специфических маркеров оценить распределение различных веществ в составе клетки и, соответственно, сделать выводы о состоянии клетки, например, степени коммитированности или метаболическом статусе, а также детектировать перерождение в опухолевую клетку. В данной работе мы использовали метод спектроскопии КР для оценки молекулярного состава клеточных пластов из мезенхимных стромальных клеток (МСК) человека, в том числе после децеллюляризации. В нашей работе для получения клеточных пластов были использованы иммортализованные человеческие МСК (hTERT MSC, ATCC), культивируемые 14 дней. В течение этого времени клетки формировали многослойный пласт, в котором клетки депонировали белки внеклеточного матрикса (ВКМ). Децеллюляризацию клеточных пластов (дВКМ) проводили по разработанному нами протоколу с использованием детергента (CHAPS) и ДНКазы I. Образцы исследовали с помощью микроспектроскопии КР с использованием конфокального КР-спектрометра NTEGRA Spectra (НТ-МДТ, Зеленоград) при лазерном возбуждении 532 нм, мощности лазера на выходе из объектива 0,5 мВт (объектив х20, NA 0.45) и времени регистрации спектров 30-60 с. Результаты проведенного исследования показали, что клеточный пласт и дВКМ неоднородны по плотности распределения белковых и липидных молекул. При децеллюляризации сохраняется третичная структура белков, однако в некоторых участках дВКМ наблюдали пики холестерина, а также урацила и цитозина. Четким отличием дВКМ от клеточного пласта являлось увеличение в составе дВКМ относительного содержания липидов по сравнению с сопоставимыми областями в клеточном пласте, в которых были проведены измерения. Этот результат демонстрирует возможности метода для детекции внеклеточных везикул с разным содержимым в составе ВКМ. Спектры от отдельно взятой клетки в составе клеточного пласта были зарегистрированы от разных участков цитоплазмы, в которых относительное содержание липидов может быть меньше, чем в слое матрикса с липидными везикулами. Кроме того, КР спектры клеток в зависимости от участка содержали пики восстановленных цитохромов дыхательной цепи митохондрий, отражая таким образом, энергетическое состояние клеток. Результаты, полученные при изучении молекулярного состава клеточного пласта и дВКМ, могут стать основой для изучения статуса МСК в трехмерных конструкциях и анализа состава бесклеточных продуктов при моделировании микроокружения клеток.