Transplantation of neurons derived from reprogrammed fibroblasts

Abstract

В связи с тем, что стационарные клеточные популяции [нейроны, кардиомиоциты) не имеют камбиальных резервов для осуществления процессов репаративной регенерации, исследуется возможность лечения пациентов с патологией ЦНС или миокарда посредством клеточной терапии [1-4]. При этом основная проблема заключается в получении иммуносовместимых клеток, способных к дифференцировке в соответствующих направлениях. Перспективным решением является использование репрограммированных аутогенных клеток, сходных с эмбриональными стволовыми клетками [ЭСК) [5, 6].

Full Text

В общем виде одной из методик репрограммирования является трансдукция вирусных транскрипционных факторов в геном клетки-реципиента, активация их и последующая селекция клеток, экспрессирующих основные гены ЭСК, ответственные за самообновление и плюрипотентность - Nanog и Oct4. В методике для индукции репрограммирования одними из первых были предложены и используются многими исследователями четыре фактора: Oct4, Sox2, c-Мyc, Кlf4 [5, 7]. Однако некоторые авторы применяют ретровирусные векторы с иным набором генов, в частности, заменяя опасный в онкогенном отношении c-Мyc [8] на Nanog [9].

Во многих работах, касающихся репрограммирования, авторы в качестве обоснования сходства ЭСК и полученных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток [induced pluripotent stem cells, iPS cells) применяют методики, позволяющие дифференцироваться клеткам исследуемой культуры в кардиомиоциты и нейроны [6, 9]. Логическим продолжением этого этапа исследования являлось бы применение методик индукции дифференцировки клеток по данным направлениям в интересах лечения животных с моделированными заболеваниями сердца или ЦНС.

Указанное направление нашло отражение в материалах исследования М. Wernig с соавт., опубликованными в журнале PNAS в 2008 году. Первый этап исследования заключался в репрограммировании мышиных эмбриональных фибробластов посредством реактивации трансдуцированных ретровирусных векторов, содержащих Oct4, Sox2, c-Мyc, Кlf4. Культура iPS клеток характеризовалась способностью формировать шаровидные эмбриоидные тела, а при культивировании в среде без сыворотки с добавлением FGF2 клетки по морфологии соответствовали предшественникам нейронов и экспрессировали транскрипционные факторы, характерные для нейральных стволовых клеток - нестин, Sox2 и Brn2. Через неделю культивирования без FGF , в культуре определялись b111-тубулин-позитивные нейроны, GFAP-положительные астроциты и O4-позитивные олигодендроциты. С течением времени инкубирования в культуре определялась все более выраженная иммуногистохимическая реакция на тирозингидроксилазу [tyrosine hydroxylase, ТН), участвующую в биосинтезе катехоламинов, и везикулярный транспортер моноаминов [vesicular monoamine transporter 2, VМAТ2), ответственный за их перемещение в синаптические пузырьки.

Исследователи трансфецировали клетки-предшественницы нейронов лентивирусными векторами с GFP [green fluorescent protein), чтобы оценить миграцию клеток в ЦНС после внутриутробного введении культуры в боковые желудочки головного мозга 13-14-дневных мышиных эмбрионов. Спустя 1-9 нед. меченые клетки были обнаружены в виде интравентрикулярных кластеров, а также субэпендимально. Наибольшее количество GFP-позитивных клеток определялось в прозрачной перегородке, полосатом теле, гипоталамусе и среднем мозге, меньшее - в обонятельных луковицах, коре и таламусе. Исследуемая популяция экспрессировала, как и в опыте in vitro, основные маркеры нейронов [b111-тубулин, NeuN) и глиальных клеток [GFAP). Привитые предшественницы нервных клеток давали начало различным подтипам нейронов: глутаматэргическим, ТН-положительным катехоламинэргическим.

Иммунофлюоресцентный анализ меченых клеток выявил их типичное нейрональное строение, а посредством конфокальной микроскопии авторы показали наличие многочисленных дендритных шипиков на нейролемме исследуемых клеток, а также непосредственный контакт с ними синаптофизин-позитивных GFP-отрицательных клеток реципиента. Электрофизиологическое исследование субвитальных срезов мозга, полученных от животных, перенесших трансплантацию, выявило проведение потенциалов действия между нативными и трансплантированными нейронами. Потенциал покоя дериватов введенных клеток находился в интервале от -55 мВ до -63 мВ, а потенциал действия достигал 70-82 мВ, что несколько выше нормальных значений. Полученные данные свидетельствуют о морфофункциональной интеграции трансплантированных клеток и нейронов реципиента.

Исследователи экстраполировали успешные результаты начального этапа работы в доклиническое исследование на мышах с дегенеративно-дистрофическим заболеванием ЦНС - болезнью Паркинсона. С целью устранения патологии взрослым животным с указанным заболеванием, смоделированным введением 6-гидроксидофамина в полосатое тело, трансплантировали культуру дифференцированных нервных клеток численностью 1-3´105 в среднего мозга. После 4 нед. эксперимента было показано, что ТН-позитивные клетки в группе опыта выявляются во всем объеме среднего мозга, а в контроле - животные с болезнью Паркинсона без трансплантационных мероприятий - положительная реакция на ТН наблюдалась лишь в части черной субстанции и в дорсальном отделе полосатого тела. Кроме того, введенные нейроны экспрессировали также n1, VМAТ2 и транспортер дофамина.

При стимуляции амфетамином движения мышей контрольной группы характеризовались вращением и уклоном в сторону, соответствующую стороне среднего мозга, в которой была нарушена функция дофаминовых нейронов посредством инъекции 6-гидроксидофамина. У большинства животных, перенесших трансплантацию iPS-полученных нейронов, наблюдалось восстановление нормального характера движений.

Исследователи показали экспрессию Кi-67 - маркера пролиферации - в области введения клеток, связывая этот факт с пролиферационной активностью трансплантированной культуры, а также выявили «тератомы», источником которых, по мнению авторов, являлись немногочисленные недифференцированные SS A1-положительные клетки, содержащиеся в культуре трансплантируемых нейронов.

Наиболее вероятно, что присутствие недифференцированных клеток было связано с недостаточной индукцией дифференцировки части iPS клеток по линии нейронов. С целью предупреждения формирования опухолей, исследователи в последующем проводили селекцию SS A1-позитивных элементов из высокоспециализированной культуры с помощью флуоресцентно-активированного клеточного сортинга, что предотвращало образование «тератом».

Таким образом, исследователи продемонстрировали возможность применения высокоспециализированных аутогенных клеток, полученных с использованием явления репрограммирования, в целях устранения дегенеративно- дистрофической патологии ЦНС. В целом, этот подход является перспективным путем решения проблемы поиска клеточного материала, предназначенного для трансплантации, при условии воспроизводимости экспериментальных результатов.