Ispol'zovanie timidinkinazy dlya otritsatel'noy selektsii indutsirovannykh plyuripotentnykh stvolovykh kletok

Abstract

Full Text

Применение дифференцированных производных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) в клеточной терапии потенциально опасно из-за риска формирования опухоли. Для элиминации клеток донора была предложена стратегия «суицидальной кассеты», содержащей «ген-самоубийцу» (suicide gene). В клетки донора вводится генетическая конструкция, содержащая тимидинкиназу (ТК) вируса герпеса, преобразующую ганцикловир в токсичный монофосфат. При действии ган-цикловира клетки гибнут. Мы поставили задачу изучить влияние места встройки «суицидальной кассеты» на выживание ИПСК при обработке ганцикловиром in vitro. Мы ввели в линию ИПСК iTAFdup22, имеющую dup3p26.3, затрагивающую ген CNTN6 (Gridina et al., 2018), генетические конструкции, содержащие ТК под конститутивным промотором. Оказалось, что селекция ганцикловиром не всегда приводит к гибели всех клеток. При обработке пяти миллионов клеток мы наблюдали следующие результаты: в клонах iTAFdup22-308, iTAFdup22-347 и iTAFdup22-348 происходила ожидаемая гибель всех клеток. В клонах iTAFdup22-e5, iTAFdup22-320 и iTAFdup22-425 образовалось от 40 до более сотни субклонов, причем выборочный анализ 55 субклонов выявил потерю ДНК трансгена только в одном. Есть три возможных механизма элиминации продукта гена ТК: 1) эпигенетическое замол-кание (предполагается в клонах iTAFdup22-e5, iTAFdup22-320 и iTAFdup22-425); 2) микроделеция участка хромосомы с ТК (показана для одного субклона); 3) элиминация гомолога хромосомы с трансгеном с последующей редупликацией интактного гомолога (не выявлена). Можно предположить, что замолкание трансгена происходит при встройке в районы неактивного хроматина. Мы установили место встройки трансгена в клоне iTAFdup22-425 - это ген CNTN6, участвующий в нейрогенезе. Район гена CNTN6 в ИПСК богат маркерами неактивного хроматина, возможно, это увеличивает вероятность замолкания трансгена. Мы планируем установить места встройки трансгенов в остальных клонах. Полученные в настоящее время результаты позволяют предположить, что для эффективной работы «суицидальной кассеты» и дальнейшего применения в клеточной терапии необходимо корректно выбирать место встройки. Линии клеток депонированы в ЦКП «Коллекции плю-рипотентных культур клеток человека и млекопитающих общебиологического и биомедицинского направления» ИЦиГ СО РАН (http://www.biores.cytogen.ru/brc_cells/ collections/ICG_SB_RAS_CELL; http://ckp.icgen.ru/cells/).