NEW CHEMICAL MODIFICATIONS OF GUIDE RNA TO IMPROVE THE EFFICIENCY OF GENOME EDITING BY CRISPR -CAS9 SYSTEM

Abstract

Full Text

За последние несколько лет система CRISPR-Cas9 стала популярным и довольно эффективным инструментом для генной инженерии. Эта система используется не только в исследовательских целях, но также для разработки новых возможных методов терапии. Возможные применения системы CRISPR-Cas9 не ограничиваются генной инженерией в привычном понимании, но также включают в себя генетический скрининг, регуляцию экспрессии генов, посредством инициации трансляции, или же, наоборот, ингибирования, а также метилирования геномной ДНК или гистонов и инкорпорация ДНК последовательностей в целевые позиции генома. Все ныне существующие модификации системы CRISPR-Cas9 направлены в основном на распознавание целевой последовательности ДНК РибоНуклеоПротеидным (РНП) комплексом, основанной на комплементарности относительно короткой олигону-клеотидной последовательности. Эффективность и специфичность связывания спейсерной части гидовой РНК и целевой ДНК особенно важна для терапевтического применения этой системы. Однако селективность этой системы все еще недостаточна для повсеместного применения в терапии. Неконтролируемые инсерции и деле-ции, которые происходят в нецелевых участках геномной ДНК, могут приводить к онкотрансформации клеток после ex vivo или in vivo генной инженерии. В нашей работе мы использовали комбинацию уже известных и новых РНК модификаций с целью улучшить характеристики системы CRISPR-Cas9 для получения возможности применять ее в терапевтических целях. Новые модификации показали стабилизацию РНК in vivo, а также меньшую токсичность по сравнению с тиофос-фатными модификациями, которые в основном используются для предотвращения деградации синтетической РНК in vivo. Мы исследовали паттерны модификаций, которые могут в дальнейшем улучшить терапевтическую эффективность и специфичность системы CRISPR-Cas9 без критического уменьшения эффективности генного редактирования и сопоставили эти результаты с уже имеющимися паттернами. Так же мы проанализировали влияние новых модификаций на эффективность системы CRISPR-Cas9, в которых использовались мутантные версии белка, обладающие большей специфичностью по сравнению с диким типом белка Cas9.