Proteomnoe profilirovanie dlya otsenki i testirovaniya rekombinantnykh adenovirusov

Abstract

Full Text

Вирусные вектора используются в качестве средств доставки в протоколах генной терапии, при этом, качество капсидных белков является неотъемлемой частью безопасности и эффективности этих продуктов. В настоящее время, наиболее распространенными векторными системами используемыми в генной терапии являются различные серотипы аденовирусов. Целенаправленное манипулирование геномом аденовирусов позволяет создавать на их основе вектора для экспрессии широкого спектра белков. Создание, очистка и тестирование рекомбинантных аденовирусов является трудоемким, дорогостоящим этапом производства генно-терапевтических препаратов. В этой связи, методы постгеномного анализа все чаще начинают использоваться для тестирования рекомбинантных аденовирусов. В частности, методы протеомного анализа базирующиеся на подходах масс-спектрометрии, для определения компонентного состава синтезированных вирусных частиц, и что не менее важно, для выяснения загрязнения препаратов остаточными клеточными компонентами после их очистки. В текущем исследовании с использованием методов высокоэффективной жидкостной хроматографии комбинированной с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-MC/MC) мы проводили белковое профилирование созданных и очищенных рекомбинантных аденовирусов кодирующих различные проангиогенные и нейротрофические факторы (VEGF, GDNF, FGF2, SDF1 и др.). Для очистки вирусов были использованы стандартные методы градиентного центрифугирования в плотности цезия. Вирусные белки фракционировали в полиакриламидном геле и расщепляли трипсином, далее проводили масс-спектрометрический анализ в формате ВЭЖХ-MC/MC. В ходе которого нами было установлено, что созданные и очищенные вирусные частицы ожидаемо содержат белковые компоненты характерные для аденовирусов пятого серотипа. В частности выявлены коровые (pV, pVII, pX), капсидные (pII, pIIIa), вершинные (pill, pVI) белки. Дополнительно нами были выявлены остаточные белковые компоненты клеток - потенциальные пирогенные и иммуногенные индукторы. Таким образом, высокочувствительные методы масс-спектрометрического анализа могут быть легко реализуемы для тестирования генно-терапевтических систем содержащих в своем составе компоненты вирусных белков, а также определения чистоты получаемых препаратов. Методология позволяет развивать таргетные подходы анализа с целью количественной оценки концентрации вирусных частиц и различных контаминантов.