FUNCTIONAL ANALYSIS OF CALCIUM-DEPENDENT POTASSIUM CHANNELS ACTIVITY IN HUMAN MYELOID LEUKAEMIA K562 CELLS

Abstract

Full Text

В предшествующих работах были исследованы ме-ханочувствительные каналы (МЧК), обеспечивающие вход катионов, в том числе ионов кальция, в клетки ми-елоидной лейкемии человека К562. С помощью метода локальной фиксации потенциала (патч-кламп) нами был показан феномен сопряженной активации МЧК и каль-ций-зависимых калиевых каналов (KCa) в плазматической мембране клеток К562 [Chubinskiy-Nadezhdin V.I. et al. 2014, Чубинский-Надеждин В.И. и др. 2019]. Мы показали, что локальный вход кальция через МЧК активирует колокализованные с ними KCa каналы, не имеющие собственной механочувствительности. По значениям унитарной проводимости в физиологических условиях в качестве молекулярных коррелятов KCa каналов могут рассматриваться как каналы малой проводимости (SK), так и средней проводимости (IK). Однозначная идентификация молекулярной принадлежности каналов возможна с помощью селективного ингибиторного анализа. Кроме того, важным вопросом остается уровень интегральной активности KCa каналов и их вклад в транспорт ионов калия в клетках К562. Целью настоящей работы было осуществить оценку вклада кальций-зависимых калиевых каналов малой (SK) и средней проводимостей (IK) в калиевые интегральные токи клеток К562. Были использованы селективные блокаторы SK и IK каналов: компонент яда пчелы - апамин и синтетический аналог клотримазола - TRAM-34 соответственно. Для регистрации интегральных ионных токов использовали метод patch-clamp в режиме отведения от всей клетки (whole-cell). SK и IK каналы активируются при внутриклеточной концентрации кальция от 10-7 М и выше. В связи с этим, в наших опытах для достижения максимального уровня активности SK и IK каналов использовали раствор, имитирующий внутриклеточный, с концентрацией кальция 10-6М. После формирования whole-cell конфигурации записывали токи от всей клетки в контроле (до подачи ингибиторов) и после добавления апами-на и TRAM-34 во внеклеточный раствор. Запись токов производили с помощью автоматического протокола (voltage step) при значениях мембранных потенциалов от -20 мВ до +80 мВ, подаваемых в течение 2 сек с шагом 10 мВ. Для оценки вклада SK и IK каналов рассчитывали средние значения интегрального тока на потенциалах от +20 до +80 мВ в контроле и после добавления ингибиторов. Достоверность изменений оценивали с помощью дисперсионного анализа (ANOVA, p<0.05). Обработка записей интегральных токов показала, что средний вклад калиевых токов, переносимых каналами SK, составляет 42,68 ± 5,59% (N=3), а суммарный вклад каналов SK и IK - 71,10 ± 9,96% (N=3) от контрольных значений калиевого тока в клетках К562. Таким образом, с помощью селективного ингибиторного анализа мы выявили функциональную экспрессию каналов SK и IK в плазматической мембране клеток К562. Результаты опытов демонстрируют, что исследуемые KCa каналы являются основной компонентой интегральных токов, переносимых ионами калия в клетках К562.