COMPARISON METHODS FOR EXOSOME ISOLATION FROM PRIMARY HUMAN GLIOMA CULTURES

Abstract

Full Text

Глиомы относят к распространенным и агрессивным опухолям головного мозга. Стандартные методы лечения, включающие резекцию опухоли, ионизирующее излучение и химиотерапию, не исключают рецидивы. Это объясняется как особенностями локализации, так и высокой гетерогенностью опухоли и резистентностью к терапии. В настоящее время одним из важных звеньев злокачественного процесса считают изменение экспрессии микроРНК, которые транспортируются, в том числе и в составе микровезикул. Однако эффективность использования экзосом и их компонентов в клинической практике в качестве онкомаркеров прежде всего зависит от методов выделения микровезикул. Задачи исследования: сравнение методов выделения экзосом из культуральной среды и плазмы крови пациентов с глиомой. Объект и методы исследования: плазма крови и материал операционной биопсии пациентов со злокачественными опухолями головного мозга (grade II-IV), диагноз верифицировался по результатам МРТ, патоморфологического исследования, иммуногистохимии. Культивирование проводили в условиях инкубатора (5% COa, 37 °C) в среде DMEM/F12 с добавлением фетальной бычьей сыворотки без экзосом (Fetal Bovine Serum exosome-depleted; Thermo Fisher) и в среде DMEM/ F12, обогащенной FGF2, EGF и B27. Экзосомы выделяли методами дифференциального центрифугирования в Exosome Isolation Kit (Invitrogen) и магнитной сепарации (Miltenyi Biotec). Верификацию выделяемых экзосом проводили методом просвечивающей электронной микроскопии и вестерн-блотт анализа маркера CD63. Результаты исследования: культивирование опухолевых клеток в DMEM/F12 с добавлением бычьей сыворотки приводит к дифференциации клеток опухоли, потенциальной потере пролиферативных и туморогенных свойств, что может искажать состав экзосом. Культивирование в среде, обогащенной FGF2, EGF и B27, сохраняет способность опухолевых клеток к продолжительному делению, способствует формированию глиосфер, способных образовывать новые колонии при пересеве. Оптимальный срок культивирования дис-соцированных клеток глиомы для выделения экзосом составляет не менее 3 дней, при сокращении срока культивирования наблюдается неспецифический сигнал на вестерн-блоте, характерный для плазмы крови, полученной от тех же пациентов, исчезающий при более длительном культивировании. Выделение экзосом c помощью Total Exosome Isolation Kit (Invitrogen) требует дополнительной очистки проб от сопутствующих липо-протеинов, что снижает концентрацию экзосом в пробе. Эффективность и селективность выделения микровезикул с помощью магнитной сепарации (Miltenyi Biotec) значительно выше: интенсивность сигнала на блоте различается в 5 раз.