Sravnitel'nyy analiz effektivnosti razlichnykh induktorov dlya miogennoy differentsirovki mul'tipotentnykh mezenkhimnykh stvolovykh kletok krupnogo rogatogo skota

Abstract

Full Text

Несмотря на возрастающее число опубликованных исследований по миогенной дифференцировке мульти-потентных мезенхимных стволовых клеток (ММСК) человека, работ с использованием клеток крупных животных моделей, в частности сельскохозяйственных животных, в данной области все еще недостаточно. Поэтому целью данного исследования было определение оптимальных условий культивирования для дифференцировки в клетки скелетной мышечной ткани (СМТ) ММСК крупного рогатого скота (КРС) под влиянием различных индукторов. В эксперименте использовали ММСК, выделенные нами ранее из костного мозга (КМ) и жировой ткани (ЖТ) КРС, на 4 пассаже и миобласты крысы L6J1 на 3 пассаже. Длительность всех протоколов дифференцировки составляла 28 сут. Согласно первому протоколу ММСК в течение 7 сут. культивировали в среде SKGM-2 с 10% сыворотки крови плодов коров (СКПК), 2% эмбрионального экстракта мышиного мозга и антибиотиками пенициллином 50 ед./мл, стрептомицином 50 мкг/мл. Далее использовали среду, стимулирующую слияние миобластов (смесь сред DMEM и F12 в соотношении 1:1, 2% сыворотки крови лошади и антибиотики). Во втором протоколе в качестве фидерного слоя для ММСК использовали инактивированные митомицином C миобласты L6J1. Клетки сокультивировали, используя только ростовую среду для ММСК (DMEM-LG, дополненная 10% СКПК и антибиотиками). Среда для дифференцировки по третьему протоколу состояла из среды для культивирования ММСК и 50% кондиционированной среды, полученной от клеток L6J1. В связи с отсутствием специфических антител, миоген-ный потенциал ММСК КРС оценивали методами фазовоконтрастной микроскопии и ПЦР-РВ по уровню экспрессии генов-маркеров миогенеза SM22a, MyoD1 и MyoG. Установлено, что применение первого протокола стимулировало появление как адипоцитов, так и образование миотрубочек, что подтверждалось высокой экспрессией генов MyoD1 и MyoG в ММСК ЖТ. В ММСК КМ в случае использования данного протокола была выявлена наибольшая степень дифференцировки в клетки гладкой мышечной ткани. Показаны высокие уровни экспрессии гена MyoD1, характерного для стадии образования мио-бластов, в ММСК КМ и ЖТ как в системе сокультивиро-вания, так и при добавлении кондиционированной среды. В целом, ММСК ЖТ обладали способностью к миоген-ной дифференцировке в ответ на индукционные стимулы в гораздо большей степени, чем ММСК КМ. Наиболее высокий потенциал дифференцировки в клетки СМТ продемонстрирован при использовании в качестве индуктора среды, кондиционированной миобластами L6J1.