Proiskhozhdenie i sud'ba masshtabnykh khromosomnykh perestroek, indutsirovannykh tekhnologiey CRISPR/Cas9 u myshey: ot zigot do somaticheskikh kletok

Full Text

В настоящее время, технология CRISPR/Cas9 широко применяется для адресного редактирования геномов животных как уровне единичных нуклеотидов, так и масштабных хромосомных перестроек. Недавно, с помощью микроинъекции компонентов системы CRISPR/ Cas9 в зиготы мышей, нами были получены животные, несущие целевые хромосомные перестройки в хромосоме 6: делеции и инверсий (размером 1137 т. п. о.) и дупликации (размером 2374 т. п. о.), затрагивающие единственный ген Cntn6 (кодирует контактин-6). Данное сообщение направлено на выяснение времени возникновения этих перестроек и их судьбы в ходе развития носителей. В нашем распоряжении было 2 фаундера (основателя), несущих одновременно дупликацию и делецию, и 5 основателей, несущих только делецию. Установлено, что наследование делеции у F1 от скрещивания пяти основателей с мышами С57BL/6 близко к ожидаемому соотношению 1:1, что указывает на отсутствие мозаициз-ма среди гамет. По данным FISH- и Саузерн-анализов, делетированный фрагмент ДНК не был выявлен на других хромосомах. Анализ последовательностей в местах, вновь образованных «стыков ДНК» у 7-ми носителей делеции, показал, что у 3-х основателей не выявлено каких-либо изменений, у 3-х других замены были в пределах от 1 до 10 нуклеотидов и одного 101 п. о. Важно, что один основатель имел «идеальную» делецию в обоих гомологах. Таким образом, эти данные позволяют сделать вывод, что целевые делеции происходили чаще в одном из пронуклеусов и с достаточно высокой точностью. Оба основателя-носители одновременно делеции и дупликации были мозаики: около четверти клеток были гетерозиготными по делеции, другая четверть гетерозиготными по дупликации и около 50% клеток с нормальным генотипом. Кроме того, и делеции и дупликации передавались потомкам F1 в соотношении близком к ожидаемому. По данным полногеномного секвенирования обе дуплицированные копии сохранили свою целостность и содержали минимальные изменения на границах «стыков». Анализируя полученные данные, мы предполагаем, что у этих основателей-носителей делеции и дупликации произошли путем межхроматидного обмена в одном из пронуклеусов на стадии зиготы и, как результат, хро-матиды с делецией и дупликацией расходятся в разные бластомеры. В целом, применение технологии CRISPR/ Cas9 позволяет получать масштабные направленные хромосомные перестройки с минимальными нецелевыми воздействиями в таргетном геноме.

About the authors

Aleksey Nikolaevich Korablev

Email: korablevalexeyn@gmail.com

Inna Evgen'evna Pristyazhnyuk

Yuliya Mikhaylovna Minina

Irina Aleksandrovna Serova

Veniamin Semenovich Fishman

Mariya Mikhaylovna Goidina

Timofey Rozhdestvensky

Leonid Gubar

Boris Skryabin

Oleg Leonidovich Serov

References

Supplementary files