Poluchenie IPSK ot patsientov s mukovistsidozom i redaktirovanie mutatsii F508del v gene CFTR s pomoshch'yu CRISPR/ Cas9



Cite item

Full Text

Abstract

Full Text

Муковисцидоз (МВ) - заболевание, обусловленное мутациями в гене CFTR, самой частой из них является F508del. В результате мутации нарушается транспорт ионов хлора и натрия через клеточную мембрану, что вызывает у пациента нарушения функционирования желёз внешней секреции. На сегодняшний день МВ не имеет этиотропной терапии. В последние годы активно развиваются методы геномного редактирования, позволяющие корректировать мутации. Одним из возможных генно-клеточных подходов к лечению заболеваний является получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) от больного, редактирование в клетках мутации, их дифференцировка, например, в клетки респираторного эпителия и последующая трансплантация больному. Целью работы было получить ИПСК из фибро-бластов больных МВ и редактировать мутацию F508del в гене CFTR с помощью CRISPR/Cas9. Репрограммирование фибробластов от трех пациентов с МВ, гомозиготных по мутации F508del, осуществляли с помощью вируса Сендай с факторами Яманака (CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit). Плюрипотентность доказывали с помощью иммуноцито-химического анализа и количественной ПЦР на маркеры плюрипотентности, а также дифференцировки в клетки трех зародышевых листков. Для редактирования мутации F508del использовали нуклеазы (eSpCas9(1.1), SpCas9(HF4) и SaCas9) в комбинации с различными sgRNA, подобранными на разные участки ДНК рядом с мутацией (sgCFTR##1, 2, 3, sa_sgCFTR#3), для репарации двуцепочечных разрывов разработали четыре одноцепочечных олигодезоксинуклеотида (ssODN-CFTR##1, 2, 3 и ssODN-saCFTR). Поскольку структура геномного сайта предположительно влияет на эффективность редактирования, указанные sgRNA также тестировали на искусственной плазмиде, содержащей локус CFTR с мутацией F508del. Анализ образованных инделов и вставок СТТ (исправление мутации F508del) оценивали с помощью NGS. В результате работы были получены и полностью охарактеризованы линии ИПСК от трех пациентов с МВ. На одной из линий проведены эксперименты по редактированию мутации F508del в гене CFTR. С учетом эффективности трансфекции частота внесения инделов в ген CFTR составила от 53 до 64% аллелей для различных комбинаций Cas9 и sgRNA. Наибольшую частоту исправления мутации F508del отмечали при использовании SpCas9(1.1)-sgCFTR#1 с ssODN-CFTR#1 - 3,5% аллелей. Результаты показывают низкую эффективность исправления мутации, не позволяющую в существующем виде использовать данную технологию для лечения больных.
×

References

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2019 Eco-Vector


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: