HRM METHOD AS A SCREENING METHOD OF THE SOMATIC MUTATION ANALYSIS IN PATIENTS WITH CHRONIC MYELOPROLIFERATIVE NEOPLASMS

Abstract

Full Text

Хронические миелопролиферативные неоплазии (ХМН) относят к клональным заболеваниям, которые характеризуются неконтролируемой пролиферацией клеточных линий миелопоэза. Установлено, что драйверные мутации в генах JAK2 и CALR лежат в основе патогенеза Ph-негативных ХМН и наблюдаются у 90% больных. На сегодняшний день для диагностики мутаций в данных генах применяются различные молекулярно-генетические методы: секвенирование по Сэнгеру, аллель-спец-ифическая ПЦР, фрагментный анализ и т. д. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки при анализе соматических мутаций. Например, сек-венирование по Сенгеру и фрагментный анализ имеют низкую чувствительность (от 10-25% и 5-10% присутствия мутантного аллеля, соответственно); аллель-спец-ифическая ПЦР в свою очередь имеет ограниченные возможности для обнаружения многочисленных и разнообразных мутаций в гене CALR. В то же время, существует удобный высокочувствительный (от 2,5% мутантного аллеля) метод high resolution melting (HRM-анализ). Его используют для скрининга образцов ДНК на наличие герминальных и соматических мутаций всех типов, встречающихся с разной частотой и разным уровнем аллельной нагрузки среди пациентов с ХМН. При HRM анализе соматических мутаций амплификатор CFX96 (Bio-Rad, США) используют гораздо реже амплификаторов Light Cycler (Roche, Франция). Цель данной работы - скрининг соматических мутаций в генах JAK2 и CALR у пациентов с ХМН методом HRM-анализа с использованием амплификатора CFX96 для пациентов с диагнозом ХМН. Для постановки HRM-анализа была взята ДНК от 5 JAK2 положительных (V617F) и 5 CALR положительных пациентов с подтвержденным диагнозом ХМН и ранее определенными мутациями и уровнем аллельной нагрузки, которая была в диапазоне 5-50%. ПЦР-HRM проводили на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США). Результаты HRM оценивали с помощью программы Precision Melt Analysis™ (Bio-Rad, США). После проведения кластерного анализа в программе Precision Melt Analysis была видна четкая разница между образцами дикого типа и остальными образцами с мутациями в исследуемых генах. Для гена CALR продукты амплификации разделились на 3 кластера: первый кластер - кривые плавления ДНК дикого типа, второй кластер - кривые плавления ДНК от образцов с мутациями по типу инсерции (c.1154_1155insTTGTC и сочетанная c.1128_1129insCTTTGCTT + c.1131_1133delAGA), третий кластер - кривые плавления от образцов с мутациями по типу делеции (c.1092_1143del и c.1099_1150del). Для гена JAK2 продукты амплификации разделились на 6 кластеров. Первый кластер соответствовал кривым плавления ДНК дикого типа, а остальные пять - кривым согласно своей аллельной нагрузке: второй кластер - образец с уровнем аллельной нагрузки 5%, третий - 15%, четвертый - 20%, пятый - 27%, шестой - 35%. Исходя из полученных результатов, можно заключить, что HRM является простым и быстрым методом для скрининга соматических мутаций в гене в генах JAK2 и CALR.