VIRAL CMV70-3P MIRNA SUPPRESSES AUTOPHAGY IN GLIOBLASTOMA CELLS

Abstract

Full Text

Медиана выживаемости пациентов с глиобластомой при лечении составляет 14-15 месяцев. В 60-90% образцов в опухолевых клетках персистирует цитомегаловирус (ЦМВ). Было показано, что валганцикловир увеличивает выживаемость пациентов до 24 месяцев. Гипотеза: ЦМВ подавляет синтез аутофагосом путем РНК-интерференции и ингибирования ферментов, что снижает активность внутриклеточного противовирусного ответа. Цель работы - изучить предполагаемые механизмы ингибирования аутофагии в клетках глиобластомы через ЦМВ-индуцируемую вирусную микроРНК. Материалы и методы. Иммунофлуоресценцией в биоптатах глиобластомы обнаруживали фосфорилиро-ванную S6 киназу и IE1 и IE2 ЦМВ. Биоинформатический анализ микроРНК проводили по TCGA, потенциальных мишеней - по STRING. Применяли культуры фибробластов MRC5, астроцитов NHA, клеток глиобластомы U87, U118, U251, инфицированные ЦМВ в дозе 5 MOI или не инфицированные. Передачу микроРНК от клеток с ЦМВ подтверждали добавлением профильтрованного через 0,4 рМ и 0,22 рМ супернатанта к клеткам, трансфицированным LC3-GFP или PKH26. МикроРНК обнаруживали с помощью qRT-PCR, маркеры аутофагии и экзосом - вестерн-блота. Результаты. В биоптатах не наблюдали колокализа-цию аутофагии и экспрессии антигенов ЦМВ. Из 505 образцов TCGA более распространена оказалась UL70-3P. Максимальное подавление аутофагии (накопление LC3-1, анти-аутофагийной изоформы) в опытах по передаче вирусной микроРНК наблюдали на 48 ч, что коррелировало с уровнем UL70-3P. Ингибирование RAB27B (задействован в биогенезе экзосом) снижало уровень про-аутофагийной LC3-II изоформы после передачи ми-кроРНк интактным клеткам. После нокдауна RAB27B гена интенсивность флуоресценции PKH26+-клеток оказалась ниже, чем в контроле. На 48 ч при сравнении инфицированных MRC5 (пермиссивная инфекция) и U87 (непермиссивная) количество UL70-3P выросло в 12 раз в U87, в MRC5 оставалось неизменным - это подтверждает связь UL70-3P с непермиссивной инфекцией. Комбинация противовирусных препаратов (Валганцикловир, Цидофовир) и OLIGO ингибитора UL70-3P приводит к снижению выживаемости клеток (U251 - на 36-57%, U118 - на 7-11%,) и уровня UL70-3P. Выводы. Работа показывает, что в глиобластоме ЦМВ способен подавлять аутофагию через передачу неопухолевым клеткам UL70-3P, предположительно, в составе экзосом (исследование продолжается), что может увеличивать миграционную и инвазивную активность опухоли и ингибировать противовирусный ответ клетки.