FOCAL ADHESION MORPHOLOGY AT INHIBITION OF ROCK AND MLCK KINASES

Abstract

Full Text

Фокальные контакты (ФК) обеспечивают физическую связь между актиновыми микрофиламентами и внеклеточным матриксом и, как следствие, способность клеток к миграции. ФК образуются в ответ на акто-миозиновое сокращение. Фосфорилирование миозина и дальнейшую контрактильность обеспечивают киназы ROCK и MLCK. В работе были проанализированы площадь и средняя интенсивность флуоресценции (ШФ) ФК в норме и при подавлении миозин ll-фосфорилирующих киназ ROCK и MLCK (10 мкМ Y27632 и 10 мкМ ML-7). Фибробласты 3Т3 и клетки остеосаркомы человека U2OS с постоянной экспрессией структурного белка ФК винкулина, конъюгированного с RFP снимали в режиме цейтраферной съемки с интервалом 5 минут в течение 8 ч. Данные представлены в виде медианы и разброса, статистически достоверные отличия по критерию Манна-Уитни (р<0.05). В клетках культуры 3Т3 площадь фокальных контактов до воздействия Y27632 составляет 0.85 мкм2 (0.08-5.45, n=93), после воздействия - уменьшается в 2.4 раза до 0.35 мкм2 (0.14-0.77, n=48). В присутствии ML-7 площадь ФК уменьшается в 2 раза с 0.9 мкм2 (0.13-8.34, n=118) до 0.45 мкм2 (0.09-1.68, n=100). СИФ до воздействия Y27632 - 2636 усл.ед.фл. (577.2-6259, n=93), при ингибировании киназы ROCK уменьшается до 2073 усл.ед.фл. (1034-3362, n=48). В присутствии ML-7 СИФ не изменяется. В клетках остеосаркомы человека U2OS площадь фокальных контактов до воздействия Y27632 составляет 1.1 мкм2 (0.2-9.06, n=231), после воздействия - уменьшается в 2.4 раза до 0.45 мкм2 (0.13-1.21, n=59). При подавлении активности киназы ML-7 площадь ФК уменьшается с 0.96 мкм2 (0.16-8.48, n=323) до 0.75 мкм2 (0.2-4.06, n=313). СИФ до воздействия Y27632 - 3085 усл.ед.фл. (103.7-10751, n=231), при ингибировании киназы ROCK уменьшается до 1565 усл.ед.фл. (3.24-4261, n=49). В присутствии ML-7 СИФ не изменяется. Таким образом ингибирование киназы ROCK приводит к разборке ФК и диссоциации винкулина из зоны ФК как нормальных, так и в опухолевых клетках. При подавлении активности киназы MLCK площадь ФК уменьшается при сохранении общего количества белка в ФК в обеих клеточных линиях.