Sozdanie i testirovanie geneticheskoy konstruktsii dlya CRISPR-oposredovannogo «vyklyucheniya» regulyatornykh posledovatel'nostey genoma, genov nekodiruyushchikh RNK i genov belkov, kharakterizuyushchikhsya mnogoobraziem splays-form

Full Text

Технологии редактирования генома позволяют изучать роль отдельных генов и функциональных элементов генома в реализации физиологических свойств и развитии патологических состояний клетки. Наиболее удобным подходом для решения такого рода задач является «выключение» целевых генов. Обычно этого можно достичь использованием нуклеазы Cas9 в комплексе с одной единственной направляющей РНК (gRNA). Однако огромное количество клеточных функций находится под контролем сложной системы регуляторных факторов, не связанных с каким-то одним кодирующим геном. При этом «выключение» регуляторных областей генома, генов некодирующих РНК (например, одной или нескольких микроРНК) и генов белков, характеризующихся многообразием сплайс-форм, т. е. вырезание определенного фрагмента целевой ДНК, представляет собой существенную проблему, поскольку требует одновременной экспрессии нескольких gRNA. По данным литературы одной из возможных схем одновременной экспрессии двух gRNA в одной генетической конструкции является клонирование обеих gRNA, разделенных тРНК, под контроль одного промотора. В таких системах транскрибируемая гибридная РНК расщепляется эндогенными эукариотическими РНКазами P и Z на отдельные gRNA и тРНК. Данная схема экспрессии gRNA реализована и в данной работе. Собранная генетическая конструкция pX458-2g кодирует остовы gRNA, разделенные тРНК (Mus_musculus_tRNA-Gly-GCC-2-4). Для клонирования спейсеров gRNA генетическая конструкция содержит сайты эндонуклеаз рестрикции S-подтипа: BbsI и BsaI. Нами показано, что одновременная экспрессия двух gRNA в одном векторе обеспечивает более эффективное вырезание фрагмента ДНК (эффективность ~ 50%), чем при использовании смеси двух векторов, каждый из которых кодирует единственную gRNA (эффективность ~ 10%). В дальнейшем планируется подтвердить эффективность полученной генетической конструкции для вырезания генов специфических микроРНК и «выключения» генов белков, характеризующихся многообразием сплайс-форм. Исследование выполнено за счёт гранта Российского фонда фундаментальных исследований - проект № 1929-04172. В работе были использованы коллекции клеток и генетических конструкций, собранных и сохраняемых в рамках проекта «Ноев ковчег», и оборудования, приобретенного за счет средств Программы развития МГУ им. М.В. Ломоносова.

About the authors

Maksim Nikolaevich Karagyaur

Daniyar Taalaybekovich Dyykanov

Email: danidy@inbox.ru

Mariya Nikitichna Skryabina

Karina Dmitrievna Rysenkova

Ekaterina Vladimirovna Semina

Anastasiya Yur'evna Efimenko

References

Supplementary files