CONSTRUCTION OF THE REPORTER SYSTEM FOR IDENTIFICATION OF TG2 INHIBITORS

Abstract

Full Text

Трансглютаминаза 2 (TG2) - мультифункциональный белок, который экспрессируется в разных тканях организма. Было показано, что ферментативная активность TG2 играет роль в клеточном ответе на протеотоксиче-ский стресс. В частности, она способствует тримеризации HSF1, тем самым обеспечивая его способность связываться с HSE элементами в промоторных участках группы генов теплового шока. Кроме того, продемонстрировано, что ферментативная активность TG2 необходима для развития гепатоцеллюлярной карциномы, что делает её потенциальной терапевтической мишенью. Целью работы было создание тест-системы для поиска ингибиторов TG2, основанной на регуляции активности HSF1. Для анализа транскрипционной активности HSE нами была сконструирована репортерная плазмида, содержащая ген CLuc (Cypridina Luciferase) под контролем промотора с HSE элементами. Использование секретируе-мой люциферазы позволяет оценить уровень активности HSF1 путём отбора культуральной среды. Для оценки зависимости экспрессии люциферазы от активности тран-глютаминазы 2 эксперименты проводились на клеточных линиях MEF и Huh7 с нокаутом гена TG2 (TG2 KO) либо с TG2 дикого типа (wt). Поскольку эффективность трансфекции может варьировать в зависимости от условий, для стандартизации результатов были получены постоянные клеточные линии с репортерной плазмидой. Далее клетки подвергались тепловому шоку, и через определённые промежутки времени проводились измерения активности люциферазы. В результате наблюдалось значительное её повышение в ответ на температурное воздействие при наличии в клетках TG2. Предполагается, что в отсутствии или при ингибировании TG2 способность HSF1 регулировать адаптацию должна быть резко снижена, что должно выражаться в пониженной экспрессии гена CLuc после теплового шока. Таким образом, данный метод позволяет в дальнейшем точно и сравнительно просто проводить поиск ингибиторов трансглютаминазы 2 на готовых клеточных линиях по отработанному протоколу.