DECELLULARIZED EXTRACELLULAR MATRIX PRODUCED BY STROMAL CELLS AS A MODEL OF PROFIBROTIC MICROENVIRONMENT IN VITRO

Abstract

Full Text

При прогрессировании фиброза основную роль играют сигналы, поступающие от микроокружения клеток. Одним из ключевых модуляторов данного процесса является внеклеточный матрикс (ВКМ), который нарабатывается преимущественно стромальными клетками, в первую очередь, фибробластами. На сегодняшний день не существует полноценной in vitro модели, воспроизводящей профиброгенные свойства ВКМ, для выяснения его роли в патогенезе фиброза. Поэтому целью данного исследования было создание in vitro модели с участием ВКМ, функционально и структурно имитирующей профи-брозное микроокружение. Для стимуляции продукции ВКМ в течение 2 недель культивировали дермальные фибробласты человека в виде клеточных пластов в присутствии аскорбиновой кислоты, фетальной бычьей сыворотки (ФБС) или лизата тромбоцитов, а также с или без добавления TGFp. Полученные мультиклеточные структуры были децеллю-ляризованы с использованием ранее разработанного протокола (CHAPS, ДНКаза I). Состав и структура полученного децеллюляризированного ВКМ (дВКМ) были охарактеризованы с помощью СЭМ, ИЦХ и дот-блоттинга на маркёры профиброзного матрикса. Мезенхимные стромальные клетки человека (МСК) культивировали на дВКМ для оценки его функциональной активности; анализировали в данных клетках экспрессию маркёров, ассоциированных с фиброзом, и фиброз-ассоциирован-ный профиль миРНК. Среди протоколов формирования профиброгенного внеклеточного матрикса оптимальными оказались условия культивирования фибробластов в присутствии ФБС и аскорбиновой кислоты. Полученный дВКМ имел трехмерную сетчатую структуру, схожую с ВКМ в многоклеточных пластах. Такой дВКМ содержал повышенный уровень EDA-FN и высокое соотношение коллагена I типа к Ill. Интересно, что добавление TGFp не оказало существенного влияния на отложение профиброгенных белков ВКМ, что может указывать на главенствующую роль источника ВКМ (фибробласты) по сравнению с условиями культивирования. МСК, культивированные на дВКМ, сохраняли веретенообразную морфологию, сходную с их формой в стромальных тканях. В этих клетках было выявлено увеличение экспрессии маркёров, ассоциированных с фиброзом (EDA-FN, альфа-гладкомышечный актин), и специфические изменения секретома (снижение секреции антифибротического фактора HGF и повышение секреции профибротиче-ских факторов SPARC и фибулина-2). Более того, профиль миРНК в таких МСК также сместился в сторону профибротического паттерна. Таким образом полученный дВКМ может быть использован для имитации и изучения профибротического микроокружения in vitro. Данные результаты могут быть применены в дальнейших исследованиях, посвященных изучению влияния микроокружения на восстановление и регенерацию тканей.