TECHNOLOGY FOR OBTAINING THERAPEUTIC PRODUCTS BASED ON THE SECRETOM OF CULTURED CELLS

Abstract

Full Text

В ряде исследований было показано, что введение в поврежденные ткани факторов, вырабатываемых клетками в процессе дифференцировки и являющихся частью их секретома, может являться сигналом для местных стволовых клеток к соответствующей диффе-ренцировке. Целью настоящей работы являлась отработка и стандартизация протокола получения концентрата кондиционированной среды от мезенхимных стволовых клеток (МСК) человека, направленных в остеогенную дифференцировку. Клетки линии FetMSC (МСК костного мозга эмбриона человека) (предоставленные РККП, ИНЦ РАН) культивировали с использованием роботизированной станции для культивирования клеток Compact Select T (Sartorius). Все работы проводились в условиях опытного производства биомедицинских клеточных продуктов ИНЦ РАН. После культивирования в питательной среде DMEM/F12 (Росмедбио, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США) была получена клеточная масса в количестве 7х108 клеток. Далее проводилось культивирование клеток сначала в дифференцировочной, а потом в бессывороточной среде и последующий сбор наработанной ими кондиционированной среды (КС). В процессе культивирования был выполнен контроль клеточных параметров в режиме реального времени: морфология клеток, жизнеспособность, пролиферация. По окончании протокола дифференцировки была проанализирована экспрессия транскрипционных факторов остеогенеза RUNX2 и YAP1 методом ПЦР в реальном времени. Было продемонстрировано увеличение экспрессии генов в 2 раза по сравнению с недифференцированными клетками, что свидетельствует о степени простимулированной дифференцировки. После сбора КС была отцен-трифугирована, профильтрована и сконцентрирована. Полученный концентрат подвергли диализу и высушиванию в вакуумном ротационном испарителе. В результате были разработаны протоколы получения концентрата секретома дифференцированных МСК, позволяющие производить подобные продукты уровня качества GMP (good manufacture practice), необходимого для их использования в медицине.