Tkanevaya inzheneriya kostnoy tkani - kletochnye i molekulyarnye mekhanizmy

Abstract

Full Text

У человека костная ткань обладает уникальной способностью к репаративной регенерации без формирования рубцовой ткани при дефектах ограниченного объема. Для восстановления кости в случае ее неспособности к самостоятельной репаративной регенерации существуют различные подходы и методы, имеющую высокую клиническую эффективность: метод дистракционного остеогенеза по Илизарову, костная ауто- и аллопластика, имплантация синтетических костнопластических материалов и др. Однако в ряде случаев (переломы вследствие высокоэнергетической травмы, включая боевые ранения; аваскулярные некрозы головки бедренной кости и таранной кости; обширные дефекты критического размера и т. д.) использование существующих методов восстановления костной ткани имеет низкую клиническую эффективность, либо приводит к неудовлетворительным результатам. Высокая социальная и экономическая значимость проблемы лечения пострадавших с нарушениями репаративного остеогенеза и дефектами костной ткани критического размера делает актуальным разработку новых подходов, основанных на принципах регенеративной медицины, к которым можно отнести использование наноматериалов, клеточную и генную терапию, тканевую инженерию. Целью исследования было изучение ex vivo клеточных и молекулярных механизмов ангио- и остеогенеза с использованием ко-культуры различных типов клеток человека: костномозговые ММСК (КМ-ММСК); периостальные прогениторные клетки (ППК) и эндотелиальные прогениторные клетки из периферической крови (ЭПК), а также оценка клинической эффективности трансплантации разработанного трехмерного тканеинженерного эквивалента кости PD-ТИЭК) для восстановления дефектов кости критического размера у пострадавших с боевой травмой (WO 2017/078654; PCT/ UA2016/000128; ClinicalTrials.gov ID: NCT03103295). В результате исследований in vitro было выявлено, что на уровне мРНК экспрессия генов, участвующих в процессах пролиферации, остеогенной дифференцировки, выживания и ангиогенеза, была обнаружена в некомми-тированных монокультурах КМ-ММСК, ППК и ЭПК; монокультуры всех трех клеточных типов экспрессировали факторы роста семейства BMP, необходимые для формирования кости. КМ-ММСК и ППК также экспрессировали ключевые факторы, контролирующие остеогенез: RUNX2, ALP, OCN и SPP1/OPN. Совместное культивирование КМ-ММСК, ППК и ЭПК в различных соотношениях значительно усиливает остеогенез (по экспрессии остеогенных маркеров на уровне мРНК, продукции факторов роста и компонентов внеклеточного матрикса на белковом уровне и в соответствии с изменением иммунофенотипа клеток), что наиболее выражено в группах ЭПК+КМ-ММСК (1:1), ППК+КМ-ММСК (1:1) и ППК+КМ-ММСК (3:1) на 7-е сутки ко-культивирования. ЭПК, ко-культивированные в прямом контакте с КМ-ММСК или ППК, усиливали остеогенные процессы in vitro, согласно изученным морфофункциональным свойствам ко-культур. В тоже время КМ-ММСК и ППК стимулировали процессы пролиферации ЭПК (на ранних этапах ко-культивирования), а на поздних этапах усиливали процессы дифференцировки и формирования 3D капилляроподобных структур эндотелиальными клетками. Для изготовления 3D-ТИЭК в качестве скэффол-да был использован частично деминерализованный алло- или ксеногенный костный матрикс в комбинации с фибриновым гелем из плазмы крови человека. 3D-конструкция засевалась аутологичными культивированными КМ-ММСК в смеси с ППК и ЭПК. Качественные и функциональные критерии 3D-ТИЭК и его активных компонентов включали: инфекционный скрининг донора и клеточной культуры, иммунофенотипирование (проточная цитометрия), кариотипирование, функциональные тесты (анализ КОЕ, направленная мультилинейная диф-ференцировка, оценка жизнеспособности и распределения клеток с помощью комбинированного окрашивания 3D-ТИЭК с помощью FDA/PI). Восстановление костной ткани с использованием 3D-ТИЭК было осуществлено у 50 пострадавших в бою с 52 костными дефектами конечностей различной локализации. Также наш биомедицинский клеточный продукт был использован для лечения аваскулярных некрозов таранной кости (3 пациента) и головки бедренной кости (5 пациентов). Восстановление дефектов кости наблюдалось через 6 месяцев после операции и оценивалось с помощью рентгенологического исследования. Результаты лечения можно клинически рассматривать, как: хорошие - формирование костной ткани с восстановлением целостности костных сегментов конечности в течение 4-6 месяцев после операции; удовлетворительные - пациенты, у которых произошел частичный лизис эквивалента в зоне трансплантации, но костная ткань сформировалась; а также пациенты, у которых произошла задержка (более 6 месяцев) формирования костной ткани после операции; неудовлетворительные - пациенты, у которых произошел полный лизис 3D-ТИЭK. Гистологический анализ образцов с хорошими результатами лечения, полученных через 3 месяца после операции, выявил формирование незрелой костной ткани. Разработанный нами биомедицинский клеточный продукт PD-ТИЭК) показал высокую клиническую эффективность при восстановлении костных дефектов критического размера с высокоэнергетическим механизмом травмы и при лечении аваскулярных некрозов головки бедренной кости и таранной кости. Использование 3D-ТИЭK стимулирует репаративный остеогенез, позволяет восстановить целостность поврежденной кости, сформировать костную ткань в месте дефекта и значительно сократить период реабилитации пациента.