Razrabotka effektivnoy xeno-free sistemy dlya ekspansii endometrial'nykh mul'tipotentnykh mezenkhimal'nykh stvolovykh kletok cheloveka

Full Text

Эндометрий человека является структурой, обладающей способностью к многократной полной регенерации и реорганизации за период репродуктивного возраста женщины (более 400 циклов). Даная способность обусловлена наличием в эндометрии пула стволовых/ прогениторных клеток (эпителиальных, мезенхимальных, эндотелиальных и т. д.). Высокий пролиферативный и мультилинейный дифференцировочный потенциал, а также иммуномодулирующие свойства и стабильность генотипа при экспансии, делают эндометриальные мультипотентные мезенхимальные стволовые (стро-мальные) клетки (эММСК) перспективным объектом для использования в регенеративной медицине. Согласно текущим регуляторным требованиям, клиническое использование биомедицинских клеточных продуктов (БМКП) на основе эММСК требует их производства в xeno-free условиях. Таким образом, разработка xeno-free протоколов культивирования является актуальной задачей ну пути разработки и трансляции в клиническую практику БМКП на основе эММСК. Образцы эндометрия (n = 10) были получены путем биопсии в пролиферативной фазе менструального цикла у женщин с гипоплазией эндометрия. Во всех случаях было подписано добровольное информированное согласие. Возраст пациентов составил 34±3,3 года. Фрагменты эндометрия были диссоциированы путем ферментативной обработки. Для изучения иммунофенотипа, времени удвоения клеточной популяции (PDT), спектра продуцируемых цитокинов, хемокинов, факторов роста и уровня экспрессии генов использовали клеточные культуры 3 пассажа. В эксперименте сравнивали морфофункциональные показатели культур эММСК in vitro, культивированных на общепринятой для ММСК ростовой среде на основе эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (контроль), а также на средах с 2% и 5% тромбоцитарного лизата (platelet lysate, PL) без добавления экзогенных факторов роста. В ходе исследования было установлено, что в культуре эММСК на П3 относительное количество клеток, имеющих классический для ММСК иммунофенотип (CD90+CD105+CD73+CD34-CD45-HLA-DR-) не отличалось в контроле и группах сравнения. Также относительное количество клеток, позитивных по CD106, CD184, CD271, CD325 было на низком, тогда как количество позитивных по CD140b, CD146 было высоким во всех группах сравнения. Также было показано, что при культивировании в xeno-free условиях наблюдается увеличение относительного количества клеток позитивных по CD140a и снижение позитивных по CD166. PDT в группе с 2% PL было значительно ниже, чем в контроле и группе с 5% PL. Достоверной разницы в значениях PDT в контроле и группе с 5% PL не было обнаружено. Анализ экспрессии генов SUSD2, ESR-1 и PGR показал, что данные гены экспрессируются на одном уровне во всех группах сравнения. В то же время происходило резкое увеличение уровня экспрессии гена ESR- 2 в группе с 2% PL. Высокий уровень экспрессии генов факторов роста наблюдался в контрольной и группе с 5% PL, тогда как в группе с 2% PL уровень экспрессии данных был низким. Мультиплексный анализ секретома эММСК показал высокую продукцию IL-1 ra, IL-8, IL-9, IL-10, IL-15, IL-17, FGF-2, G-CSF, GM-CSF, IFN-p, MCP- 1, TNF-а в контрольной и экспериментальной группах. Следует отметить, что в группе с 2% PL наблюдался самый высокий уровень продукции IL-6 и эотаксина. Продукция VEGF, PDGF-ВВ, RANTES, IL-12 увеличивалась в зависимости от концентрации PL. Продукция IP-10 было значительно снижена в экспериментальных группах по сравнению с контролем. Обобщая все вышесказанное, наши результаты показывают возможность производства БМКП для использования в области регенеративной медицины на основе эММСК, при их экспансии в условиях xeno-free системы и без потери их основных морфофункциональных свойств.

About the authors

Alena Vasil'evna Zlatskaya

Email: alenazlacka@gmail.com

Natal'ya Mikhaylovna Todosenko

Anzhela Evgen'evna Rodnichenko

Inna Mikhaylovna Gordienko

Ol'ga Sergeevna Gubar'

Dmitriy Aleksandrovich Zubov

Svetlana Nikolaevna Novikova

Larisa Sergeevna Litvinova

Roman Gennadievich Vasil'ev

References

Supplementary files