INTRODUCTION OF ALPHOID HUMAN ARTIFICIAL CHROMOSOME CARRYING FVIII GENE INTO IPS CELLS OBTAINED FROM HEMOPHILIC MOUSE FIBROBLASTS

Abstract

Full Text

Искусственные хромосомы человека (ИХЧ) обладают рядом преимуществ перед другими экспресионными векторными системами. Самыми важными свойствами ИХЧ являются их автономность в геноме хозяина и большая ёмкость [1]. Ранее нами было показано, что альфоидная ИХЧ в индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клетках мыши не влияет на плюрипотентные свойства этих клеток и позволяет обеспечить устойчивую экспрессию генов, находящихся в её составе [2]. В данном исследовании нами была произведена загрузка гена фактора свёртываемости крови 8 (FVIII) в аль-фоидную ИХЧ, находящуюся в клетках линии CHO. Мы получили две линии клеток СНО с альфоидной ИХЧ: в одном случае ген FVIII находился под промотором цитомегалови-руса (промотор CMV), в другом случае - под промотором фактора элонгации трансляции 1 (промотор EF1 alpha). С помощью вэстерн блота мы показали экспрессию гена FVIII в обоих линиях клеток СНО. Параллельно мы получили ИПС клетки из фибробластов мыши гемофильной линии B6;129S-F8tm1Kaz/J. Альфоидные искусственные хромосомы с геном FVIII под разными промоторами были доставлены из клеток линии СНО в полученные нами ИПС клетки мыши. Анализ экспрессии гена FVIII в ИПС клетках с помощью вэстерн блота позволил выявить фактор свёртываемости в тех клетках, где ген FVIII в составе альфоидной ИХЧ находился под промотором EF1 alpha, тогда как в тех клетках, где ген FVIII находился под промотором CMV, экспрессии выявлено не было. В ходе дальнейших исследований мы планируем изучить возможность исправить гемофильный фенотип мышей линии B6;129S-F8tm1Kaz/J с помощью изогенной трансплантации полученных нами мутантных ИПС клеток мыши с геном FVIII в составе иХч под промотором EF1 alpha.