FUNCTIONALLY-ACTIVE ENAC CHANNEL IN THE MEMBRANE OF K562 CELLS CONTAINS S-SUBUNIT

Abstract

Full Text

Потенциал-независимые натриевые каналы идентифицированы как один из основных путей входа натрия, определяющих быстрые изменения натриевой проницаемости в трансформированных клетках крови. Натриевые каналы в клетках миелоидной лейкемии человека К562 были названы «актин-управляемыми» на основании внутриклеточного механизма их активации и инактивации. По своим физиологическим характеристикам они близки к каналам семейства ENaC, за исключением чувствительности к ингибитору амилориду. Недавно обнаруженная внеклеточная активация актин-управляемых каналов при наружном приложении сериновой протеазы трипсина подтверждает принадлежность исследуемых каналов к семейству ENaC. Ранее сообщалось, что каналы ENaC, содержащие в своем комплексе S-субъединицу вместо a-ENaC, обладают сниженной чувствительностью к амилориду. Целью работы являлось изучение возможного участия S-субъединицы ENaC в составе функционально-активного натриевого канала в клетках К562. В первой серии экспериментов предполагаемое участие S-ENaC в формировании натриевого канала в клетках К562 было проверено в опытах с использованием трипсина (5 мкг/мл) в качестве внеклеточного активатора. В конфигурации whole-cell метода патч-кламп регистрировали трипсин-активируемые токи через одиночные каналы в Na+- или Ы+-содержащем наружном растворе. Проводимость каналов для Li+ (145 мМ) снижена по сравнению с Na+ (145 мМ) и составила 10 и 15.5 пСм, соответственно. Эта особенность является основным биофизическим признаком ENaC, содержащих в своем комплексе S-субъединицу. Результаты ОТ-ПЦР анализа и иммунофлуоресцентного окрашивания также подтвердили экспрессию S-hENaC (наряду с a-, р-, y-ENaC) на уровне мРНК и белка в клетках К562. В экспериментах whole-cell впервые было обнаружено, что подача во внеклеточный раствор капсазепина (1-5 мкМ), активатора S-ENaC, вызывала активацию натриевых каналов с типичными характеристиками; проводимость каналов составила около 15 пСм.Биофизические характеристики каналов, активированных капсазепином, совпадали с характеристиками каналов, активируемых при разборке цитоскелета (Цитохалазин Д, 10 мкг/мл) или при действии трипсина. Аналогично, при замене Na+-содержащего раствора в камере на Li+юодержащий наблюдали уменьшение амплитуды токов - проводимость снижалась до 1 0 - 1 1 пСм. Мы установили, что после замены ионов Na+ на Li+ снижалась амплитуда открытого состояния только части каналов, активированных ЦитД. Кроме того, при разборке цитоскелета или действии протеазы активацию каналов наблюдали в 1 00% экспериментов whole-cell (для ЦитД n=1 5), а при действии капсазепина - в 33% (n=18). Полученные результаты дают аргументы в пользу того, что в мембране клеток К562 присутствуют две популяции функционально-активных каналов ENaC c разным субъединичным составом: аРу- и SPy-ENaC.