CONTRIBUTION OF EXTRACELLULAR MATRIX COMPONENTS PRODUCED BY MESENCHYMAL STROMAL CELLS IN REGULATION OF STEM CELL DIFFERENTIATION

Abstract

Full Text

Ключевыми участниками обновления и регенерации большинства органов и тканей являются постнатальные стволовые и прогениторные клетки. Неотъемлемой частью специфического микроокружения, или ниши стволовой клетки, являются мезенхимные стромальные клетки (МСК), однако механизмы их участия в регуляции пула стволовых и прогениторных клеток остаются не до конца изученными. Показано, что выделенные из разных источников МСК представляют собой гетерогенную популяцию клеток, включающую небольшое количество стволовых и прогениторных клеток, которые могут дифференцироваться в адипогенном, остеогенном, хондро-генном, а также некоторых других направлениях. При этом многие ключевые функции МСК реализуются через действие секретируемых факторов, внеклеточных везикул и компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ), что указывает на наличие других подтипов клеток, которые обладают преимущественно регуляторной функцией. По нашим данным наиболее представленной в секре-томе МСК группой факторов являются компоненты ВКМ. В данной работе мы исследовали механизмы влияния ВКМ, наработанного МСК, на дифференцировку стволовых клеток, содержащихся в популяции МСК. Для этого нами были разработаны подходы к получению децеллюляризированного ВКМ (дВКМ), компоненты которого секретируются МСК человека (ASC52telo, ATCC), культивируемыми в виде клеточных пластов. С помощью иммуногистохимического анализа и сканирующей электронной микроскопии было показано, что дВКМ имеет сетчатую многослойную структуру, а децеллюляризация не приводит к денатурации белков и нарушению компартментализации ключевых структурных компонентов ВКМ (коллагенов, фибронектина, ламинина). Влияние дВКМ на диффе-ренцировку первичных МСК жировой ткани человека в адипогенном и остеогенном направлениях оценивали по гистохимическому окрашиванию и подтверждали с помощью ПЦР в реальном времени. Мы показали, что дВКМ существенно стимулирует дифференцировку МСК в обоих направлениях: так, уже на 4 день наблюдали выраженные различия между клетками, культивированными на дВКМ и пластике или пластике, покрытом отдельными компонентами ВКМ. С помощью обработки клеток RGD пептидом был показан вклад интегринов в реализацию этого эффекта. При оценке изменений внутриклеточного сигналинга в МСК с помощью вестерн-блота белков ядерной и цитоплазматической фракций было показано, что при культивировании на дВКМ в клетках снижена экспрессия основных участников сигнальных путей, таких как pERK и активный бета-катенин, что коррелирует с пролиферативной активностью клеток и их способностью отвечать на индуцирующие дифференцировку сигналы. Полученные данные расширяют понимание роли ВКМ, продуцируемого МСК, в регуляции дифференци-ровки стволовых клеток. Результаты наших исследований могут стать основой для разработки новых подходов для регенеративной медицины с использованием нативного ВКМ, наработанного МСК. Работа выполнена при поддержке РНФ (проект № 19-75-30007). приводящих к направленной дифференцировке определенных типов клеток морских гидробионтов. Для большинства организмов СК взрослых особей редки и трудны для изучения. У некоторых морских беспозвоночных, в связи с повышенной их способностью к регенерации и наличием у них бесполого размножения, существует постоянный высокий пул СК, обладающих потенциалом, сопоставимым с таковым яйцеклетки. При культивировании клеток морских гидробионтов важнейшие из проблем, с которыми приходится сталкиваться, - контаминация и низкая пролиферативная активность клеток в культурах. Важным направлением исследований является поиск условий, при которых эти клетки могли бы активно делиться. Как показывают наши и литературные данные, введение онкогенов в клетки морских беспозвоночных (ежей, устриц, крабов и креветок), не увеличивает скорость роста клеток. Только встраивание чужеродного гена, кодирующего один из факторов транскрипции, в область генов факторов роста дало эффект - получены быстро делящиеся клетки морского ежа. Сейчас нами разработаны технологии, которые позволяют «включить» программы специализации и контролировать дифференцировку клеток этих животных in vitro, получая нужные экспериментатору клетки (например, пигментные клетки плоских морских ежей, продуцирующие эхинохром) без использования трансгенов. Кроме того, мы разработали эффективные способы идентификации вирусных патогенов в культурах клеток крабов и исследовали взаимодействие вируса с клетками хозяина. Начаты эксперименты по ре-программированию генома соматических клеток (фибробластов кожи) морских млекопитающих в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки с помощью генов, кодирующих факторы транскрипции и белки, регулирующие различные функции эмбриональных СК. Отдельным блоком стоят исследования, связанные с поиском новых криопротекторов и направленные на исследование механизмов криоустойчивости морских гидробионтов и развития методов их криоконсервации. Антиоксиданты, как отдельные компоненты криопротекторной смеси, не обладают криопротекторными свойствами. Таким образом, для различных видов морских гидробионтов разработаны условия культивирования, приводящие к направленной дифференцировке определенных типов клеток. Кроме того, для нужд биотехнологии и сохранения генетических ресурсов создан единый Криобанк.