Kolichestvennaya otsenka miogennoy differentsirovki kletochnoy linii C2C12 s ispol'zovaniem polietilenglikolya i induktsionnykh sred in vitro

Abstract

Full Text

Наследственные миодистрофии - группа заболеваний, характеризующаяся прогрессирующим поражением мышц, инвалидизацией и, в большинстве случаев, гибелью больного в трудоспособном возрасте. Потенциальным подходом к лечению рассматривается генная терапия, в которой в качестве вектора будут использоваться клетки миогенных линий с отредактированным геномом. Ключевым событием доставки терапевтического гена в поврежденные клетки является феномен клеточного слияния. Разработка методов индукции этого процесса может повысить эффективность самого лечения. Одним из артифициальных индукторов слияния клеток является полиэтиленгликоль (ПЭГ). Цель эксперимента - воссоздать дифференцировку клеточной линии C2C12 in vitro, используя индукционную среду, с предварительной обработкой клеток ПЭГ и без нее, оценить индекс клеточного слияния. В работе использовали линию иммортализованных миобластов мыши - C2C12. Изначально, клеточная линия культивировалась с использованием стандартной ростовой среды DMEM F12, 20% телячьей сыворотки (FBS) с добавлением фактора роста фибробластов и антибиотика. После достижения конфлюэнтности, клетки пересеивались на 12-луночный планшет в количестве 8х104 на лунку. Предварительную обработку ПЭГ 1450 производили путем ресуспендирования преципитата клеток в 1 мл 50% р-ра ПЭГ с DMEM F12 в течении 90 с. с последующей очисткой от ПЭГ центрифугированием. На следующий день переводили культуры на индукционную среду DMEM HG, 2% FBS со сменой среды раз в 3 дня. Наблюдение и фотофиксацию осуществляли на увеличении х200 с интервалом в 24 часа, с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа на протяжении 10 дней после внесения индукционной среды. После фиксации, в образовавшихся многоядерных структурах была с помощью РИФ детектирована экспрессия Миогенина (MyoG), дисферлина, а-гладкомышечного актина, из чего следует атрибутировать многоядерные клеточные структуры как формирующиеся мышечные трубочки (миотубы). Клетки, обработанные ПЭГом, погибали и откреплялись на 3 сутки эксперимента, снижая конфлюэнтность до 20-30%. С помощью оригинальной формулы (Рационализаторское предложение № 1393, РязГМУ) был рассчитан индекс клеточного слияния (I) в день внесения индукционной среды, спустя 2 и 10 суток. Без обработки ПЭГ: 5,94±2,87; 3,83±1,3; 37,23±14,33 соответственно. С обработкой ПЭГ: 28,56±11,49; 19,57±10,59; 0 соответственно. Можно сделать вывод, что полученные в результате ПЭГ-опосредованного слияния многоядерные клетки имеют низкую выживаемость.