DEVELOPMENT OF TECHNOLOGIES FOR AUTOLOGOUS SKIN EQUIVALENTS AND SKIN DERIVATES GENERATION FROM PLURIPOTENT CELLS

Abstract

Full Text

На текущий момент одной из важных проблем регенеративной медицины является дальнейшее развитие технологий получения и трансплантации живых эквивалентов кожи, которые могут быть использованы как для терапии ряда генетических заболеваний кожи, так и в качестве репрезентативной модели для изучения морфогенеза кожи и симуляции воздействия различных веществ на нее. Одним из перспективных источников клеточного материала для генерации ЖЭК являются индуцированные плюри-потентные стволовые клетки человека (чИПСК). Основной нерешенной проблемой получения ЖЭК являются отличия структуры, клеточного состава и состава внеклеточного матрикса в составе ЖЭК от его нативного аналога, а также отсутствие дериватов кожи. Целью работы было получить в ходе направленной дифференцировки чИПСК эпидермальную и дермаль-ную клеточные линии, пригодные для получения ЖЭК и волосяных фолликулов in vitro. В результате дифференцировки чИПСК были получены аналог кератиноцитов (ИПСК-Кц) и аналог клеток дермальной папиллы (ДП) волосяного фолликула (ИПСК-ДП). Затем полученные клеточные линии были верифицировали при помощи иммуноцитохимического анализа и РВ-ПЦР выявления маркеров кератиноцитов (p63, К14, К18, К10 и др.) и маркеров ДП (версикана, ви-ментина, фибронектина, гладкомышечного актина и др.) соответственно, а также функционального теста на индукцию фолликулогенеза in vivo после введения ИПСК-ДП под кожу иммунодефицитных мышей линии nude с последующим иммуногистохимическим выявлением эпидермальных маркеров (К6 и К14) в составе сформированных de novo кожных органоидов в препаратах, полученных из зоны введения. На следующем этапе работы ИПСК-ДП и ИПСК-Кц использовали для получения в системе transwell ЖЭК и органоидов, имитирующих ранние стадии фолликулоге-неза, в системе «висячая капля». Образцы полученных препаратов использовали для иммуногистохимического выявления маркеров клеток дермальной папиллы (фи-бронектина и версикана), базальной мембраны (коллаген IV) и кератиноцитов (К14). Полученные результаты подтверждают целевой фенотип полученных клеточных линий и их способность к взаимной интеграции в трехмерные клеточные системы, что позволяет утверждать, что разработанные методы и полученные клеточные линии могут быть использованы для получения полноценных ЖЭК и дериватов кожи in vitro.