TRANSFORMING GROWTH FACTOR (TGF-BETA) REGULATES THE ASSEMBLY OF 3D CARDIAL SPHEROIDS

Abstract

Full Text

В тканях организма человека взаимодействие клеток между собой и компонентами межклеточного матрикса реализует сеть биохимических и механических сигналов, имеющих важное значение для поддержания клеточного гомеостаза. Были предприняты многочисленные попытки разработать трехмерные модели клеточных культур для изучения их свойств и понимания механизмов регуляции клеточного микроокружения in vivo. Одной из таких моделей кардиального микроокружения являются кардиосферы (КС) - гетерогенная популяция прогениторных клеток сердца, которые способны самопроизвольно воссоздавать 3D микроокружение, подобное «клеточным нишам» миокарда, и обеспечивать сохранение межклеточных контактов, принципов метаболического и секреторного регулирования. Однако механизмы, регулирующие их формирование, остаются малоизученными. Цель исследования: изучить влияние TGF-beta на сборку 3D кардиальных сфероидов. В работе использованы образцы миокарда мышей C57Bl6. Для получения эксплантной культуры использовалась среда IMDM, 20% фетальной сыворотки теленка (ФСТ), глутамин, 2-меркаптоэтанол (МЭ), антибиотики; для сборки кардиосфер - комбинированная среда 35% IMDM/65% DMEM-F12, 3% ФСТ и ростовые факторы. Исследование иммунофенотипа проводили с помощью метода иммунофлуоресцентного окрашивания, экспрессию генов sNai/SLUG - ПЦР в реальном времени. Мы обнаружили, что клетки эксплантной культуры в соответствующих условиях способны формировать КС, представляющие собой кардиальные сфероиды, в центральной части которых локализуются клетки, экспрессирующие маркеры стволовых клеток Oct4 и c-kit, окруженные клетками мезенхимального фенотипа (CD105+, CD73+) и сосудистыми/кардиальными клетками-пред-шественницами (Gata4+, Pecam+, SMA+). Пересадка КС в среду с высоким содержанием сыворотки способствует их «разборке» и получению 2D культуры клеток. Образование КС сопряжено с повышением экспрессии генов-индукторов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) по сравнению с 2D культурой: SNAI (>5 раз] и SLUG (>7 раз). Добавление TGF-beta - классического индуктора ЭМП - приводило к активации сборки крупных и мелких сфероидов. Напротив, воздействие ингибитора SB431542 в комбинации с TGF-beta нарушало процесс сфероидогенеза, что проявлялось в увеличении числа первичных клеточных скоплений и снижением количества полноценных 3D структур. Таким образом, TGF-beta способствует сборке КС, которая сопровождается повышением экспрессии генов SNAI/SLUG, что указывает на возможное участие ЭМП в процессе их формирования. КС имеют сложную трехмерную организацию, сформированную разными типами клеток и белками внеклеточного матрикса, что позволяет их рассматривать в качестве 3D модели кардиального микроокружения ex vivo для биомедицинских исследований.