Urokinaznyy retseptor reguliruet formirovanie kardiosfer

Abstract

Full Text

В настоящее время технология использования сфероидов (СФ) на основе клеток миокарда является новым перспективным направлением клеточной терапии повреждений сердца, повышающим ее эффективность. Однако для клеточной терапии необходимо получение стандартизованной культуры кардиосфер (КС), имеющих определенный размер, клеточный состав и репаратив-ные свойства. Формирование 3D клеточной структуры требует скоординированной работы различных сигнальных механизмов, включая урокиназную систему, контролирующих адгезию клеток к матриксу, межклеточные взаимодействия, пролиферацию и поверхностное натяжение клеток первичного СФ. Цель исследования: изучить влияние урокиназно-го рецептора (uPAR) на формирование КС из клеток миокарда. Методы. В работе использованы КС, полученные из миокарда мышей линий WT C57Bl6/129 и uPAR-/-C57Bl6/129 с помощью метода эксплантаной культуры и последующей сборки СФ на чашках с поли-Д-лизином в среде с низким содержанием сыворотки. Подавление экспрессии uPAR в Wt клетках выполняли с использованием shRNA лентивирусных частиц ("Santa Cruz”) и последующей селекцией на пуромицине. Оценку размера и количества СФ проводили с помощью программы Image J. Уровень адгезии клеток исследовали с помощью Adhesion assay. Результаты. Показано, что uPAR присутствует на поверхности 71+8% кардиосферообразующих клеток в составе 2D культуры и собранных СФ. Были выявлены различия в формировании СФ из Wt и uPAR-/- клеток. Через сутки после посадки на культуральные чашки клеточных суспензий наблюдалось формирование первичных клеточных агрегатов, которые являются «ядром», инициирующим сборку СФ. При этом если в культуре Wt клеток наряду с ними, наблюдались полностью собранные СФ, то в культуре uPAR-/- клеток они отсутствовали. Через 2 суток с момента посадки клеток, сформированные СФ наблюдались в обеих культурах. В культуре Wt клеток выявлялись СФ ад-гезионнного и неадгезионного типа крупного размера (100-150 мкм). uPAR-/- клетки формировали в 3 раза большее больше СФ, чем Wt клетки, но они имели преимущественно мелкий размер (менее 50 мкм). Подавление uPAR с помощью специфических shRNA снижало адгезионные свойства клеток и приводило к нарушению сборки СФ и появлению КС меньшего размера. Таким образом, uPAR, оказывая влияние на адгезионные свойства кардиосферообразующих клеток, регулирует сборку СФ. Регулируя экспрессию uPAR можно получать КС разного размера, что может быть важно для их использования в клеточной терапии заболеваний сердца.