Bezfidernaya kul'tura kletok epiteliya slizistoy guby cheloveka dlya kletochnoy transplantatsii pri zabolevaniyakh rogovitsy

Abstract

Full Text

Введение. Роговица человека в норме покрыта не-ороговевающим многослойным плоским эпителием, который обновляется за счет лимбальных эпителиальных стволовых клеток (ЛЭСК). Обширное повреждение ЛЭСК, приводит к синдрому лимбальной недостаточности (СЛН), а его двустороння форма вызывает слепоту и слабовидение. Для лечения таких состояний изучается эффективность аутотрансплантации культивированных клеток эпителия полости рта. Цель. Разработка метода получения культуры клеток эпителия слизистой губы человека без фидерных клеток и биопокрытий. Материалы и методы. Ткань слизистой губы была получена от 6 пациентов при выполнении оперативных вмешательств после подписания информированного добровольного согласия. Для посева использовали эпителиальную часть экспланта, отсепарованную от под-слизистого слоя. Культивирование проводили в базовых средах DMEM/F12 (1,05 мМ кальция) и EpiLife (0,06 мМ кальция), содержащих 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% антибиотик-антимикотик, а также инсулин, гидрокортизон и эпидермальный фактор роста. Первичную культуру окрашивали на маркеры: p63 (стволовость, пролиферация), виментин (промежуточные филаменты) и ZO-1 (плотные межклеточные контакты тип 1 ). Изображения анализировали в программах Fiji и CellProfiler. Результаты. Первичная культура клеток эпителия слизистой губы была получена от всех доноров в обоих культуральных средах. Морфология клеток соответствовала типу «булыжная мостовая», однако в среде с 1,05 мМ кальция отмечали больше открепившихся клеток и наличие дебриса. Количество клеток, положительных на ядерный маркер p63, в средах DMEM/ F12 и EpiLife составило 34,7% и 39,2% (медиана, n=3) соответственно. Экспрессия виментина в группах значимо не различалась. По данным анализа, длина участков экспрессии белка ZO-1 составила 17,05 и 5,18 мкм на клетку (медиана, n=3) в средах DMEM/F12 и EpiLife соответственно. Заключение. По результатам проведенного исследования были получены культуры клеток эпителия слизистой губы человека без применения фидерных клеток и биопокрытий с использованием только трёх специфических фактора роста. При культивировании в среде DMEM/F12 отмечено повышение длины плотных межклеточных контактов, что может быть использовано при моделировании дифференцировки эпителия in vitro. Культивирование в среде EpiLife способствует повышению количества пролиферирующих клеток эпителия. Следовательно, описанный метод перспективен для использования в клеточной трансплантации у пациентов с двусторонним СЛН.