Regulyatsiya osteogennoy differentsirovki mul'tipotentnykh mezenkhimal'nykh stromal'nykh kletok putem nokdauna gena glikogensintazy kinazy-3r

Abstract

Full Text

Актуальность. Разработка новых методов восполнения дефектов костной ткани, направленных на регуляцию дифференцировки остеогенных прогениторных клеток, является актуальной задачей регенеративной медицины. Одним из ингибиторов остеогенеза выступает гликогенсинтаза киназа GSK-3P, который посредством фосфорилирования р-катенина уменьшает уровень экспрессии ключевого транскрипционного фактора остеобластов Runx2. Снижение количества мРНК GSK-3P в результате нокдауна с помощью молекул siPHK может существенно повысить эффективность остеогенной дифференцировки клеток-предше-ственниц в процессе репаративного остеогенеза. Цель исследования. Оценка влияния нокдауна GSK-3e на развитие остеогенной дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). Материалы и методы. Для нокдауна GSK-3P были выбраны 4 молекулы siPHK, направленные на 4, 7, 8 и 10 эк-зоны в составе мРНК данного гена. ММСК жировой ткани человека на 3 пассаже инкубировали с полиплексами, состоящими из молекул siPHK и полимера TurboFect (TF) N/P 1:2 в 24-луночном планшете в течение 24 часов в среде Opti-MEM с 5% ЭТС. После трансфекции среду заменяли на ДМЕМ с 10% ЭТС, 4 mM L-глутамина, 100 мг/л амикацина. Эффективность трансфекции определяли с помощью контрольной молекулы siPHK, не направленной ни на один известный ген человека, с флуоресцентной меткой 6-FAM. Цитосовместимость полиплексов анализировали с помощью МТТ-теста на 1, 2 и 5 сутки после трансфекции. Уровень экспрессии мРНК GSK-3P и Runx2 оценивали с помощью РТ-ПЦР. Результаты. По данным МТТ-теста была определена оптимальная концентрация siPHK - 50 пмоль/мл, при которой количество живых клеток на 5 сутки после трансфекции варьировалось от 71,7% до 87% от значений контрольной группы. Эффективность трансфекции ММСК полиплек-сами, содержащими 50 пмоль/мл siPHK составила 97,2±2,4%. На 5 сутки после проведения нокдауна уровень экспрессии GSK-3e снизился в 2,3-5,2 раза, а уровень экспрессии Runx2 вырос в 2,5-7 раз в зависимости от молекулы siPHK. Таким образом, было показано, что эффективность остеогенной дифференцировки в культурах ММСК может быть повышена при нокдауне гена GSK-3P с помощью молекул siPHK.