Proverka fenotipicheskoy stabil'nosti geneticheski izmenennykh kletok otobrannykh metodom khimernogo sortinga

Abstract

Full Text

Развитие генной терапии и Crispr/Cas9 метода геномной модификации клеток для клинического применения в клеточной трансплантологии требует новых подходов к отбору генетически измененных клеток. Вероятность инсертного мутагенеза из-за интеграции генно-инженерной кассеты в случайный сайт в геноме, остается достаточно высокой. Затрагивая гены, необходимые для нормального функционирования клетки, такая вставка будет делать клетку-хозяин патогенной. При трансплантации нескольких миллионов модифицированных клеток, в организм может быть введено до нескольких сотен потенциально патогенных клеток. Значительно снизить эту вероятность возможно получив стабильную, генетически однородную линию, проверенную на иммуногенность для пациента, с известным потенциалом клеточных делений после трансплантации. Прим.в конструкцию pEYFP-CBD-PDGFR мы получили стабильные генетически однородные клеточные линии. Цель: проверить моноклональность полученных линий методом предельных разведений, сделать анализ клеточного пула методом ифа, исследовать возможность метода получать линии как с генотипической стабильностью, и сниженным фенотипическим разнообразием. Материалы и методы. Трансфекция клеточной линии CHO-S проводили, используя липофильный агент FreeStyle MAX (Invitrogen) в 6-луночных планшетах (FreeStyle CHO-S Cells, Invitrogen, Cat. # R800-07). Проверку моноклональности стабильных клонов- проводили методом предельных разведений. Концентрацию EYFP определяли ифа анализом Anti-GFP antibody Cat. # AB011 (Евроген, Россия). Результаты: Из 0,5x106 клеток получивших трансген трансфектантов, были получены клеточные линии с высокой, стабильной (20-35 пассажей) экспрессией модельного белка. Концентрация целевого белка в не-оптимизированных условиях после трех дней культивирования трех производительных клонов достигла (мг/л): 72,7±3,2; 83,5±12,1; 380,4±14,5. Скорость роста линий при этом составляла (часов/деление): 19,7±1,1; 22,1±1,4; 22,2±1,2. Стабильная линия может быть получена уже через 1 5 суток после трансфекции. Безопасность для организма-хозяина линии, стабильность, параметры вставки и соответствие необходимым характеристикам могут быть проанализированы одновременно с наработкой необходимого для применения количества клеток. Выводы. При использовании этой селективной системы возможна эффективная селекция генетически модифицированных клеток с генотипической стабильностью, и сниженным фенотипическим разнообразием метаболизм которых минимально отличается от исходных клеток организма.