Directed differentiation of human embryonic stem cells into endoderm

Full Text

Одной из наиболее сложных задач в развитии методов направленной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток [ЭСК] считается индукция их развития по эктодермальному пути. Вместе с тем, решение этой проблемы позволит вплотную подойти к получению клеток поджелудочной железы и печени для их последующей трансплантации больным людям. Об актуальности такой работы говорит хотя бы тот факт, что число страдающих сахарным диабетом 1-го типа приближается во всем мире к 60 млн. Недавно группа калифорнийских исследователей из компании CyThera Inc. заявила, что получила обнадеживающие результаты в этом направлении [1].

В ходе онтогенеза энтодерма млекопитающих обособляется в первую фазу гаструляции - в ходе деляминации [расслоения эпибласта с образованием экто- и энтодермы]. В дальнейшем, в соответствии с учением Н.Г. Хлопина, этот зародышевый листок дает начало эпителиям эктодермального типа - эпителию желудка, кишечника, печени, желчевыводящих путей и желчного пузыря, поджелудочной железы [рис.]. Еще в середине XX века было отмечено, что эпителии этого типа плохо поддаются культивированию in vitro [2].

Традиционной моделью для изучения эктодермального эпителия служит эпителий желточного мешка, что, естественно, учитывает их гистогенетическое единство [см. рис.]. Именно с этими клетками были проведены эксперименты по направленной дифференцировке под влиянием факторов микроокружения - мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток [ММСК] [3]. Показано, что в отсутствии влияния мезенхимы клетки энтодермы дифференцируются в клетки слизистого типа, но только при кокультивировании с ММСК - в типичные энтероциты с выраженной щеточной каемкой. В последнее время удалось наблюдать образование слоя клеток в культуре с синтезом морфофункционально полноценной базальной мембраны [4, 5].

Ряд исследователей считает, что для перспективного клинического применения работы с ЭСК представляются наиболее целесообразными. Кроме того, in vitro система дифференцировки ЭСК служит отличной моделью эмбриогенеза. Калифорнийские авторы применили оригинальную методику культивирования этих клеток с пониженным содержанием сыворотки и в присутствии активина А - представителя суперсемейства TGF-p. Через 5 дней культивирования до 80% клеток культуры демонстрировали экспрессию генов энтодермальной дифференцировки - 80X17, F0XA2. В дальнейшем клетки были очищены при помощи положительной селекции по поверхностному рецептору CXCR4, при этом частота выделенной популяции стремилась к 100%. Через 5 недель после трансплантации этих клеток под почечную капсулу иммунодефицитным мышам обнаружили сформированные эпителиодные структуры, образующие однослойные мембраны.

Иммуногистохимическое исследование на основные эктодермальные маркеры [CDX2, ѴіІІіп - маркеры кишечного эпителия, HSA - специфический печеночный антиген] показало, что данные клетки способны in vivo прогрессивно реализовывать эктодермальную программу дифференцировки.

Об особом методе направленной дифференцировки ЭСК по энтодермальному пути было заявлено и ранее группой Ron McKay [6], однако работа была выполнена с клетками мыши. Авторы интуитивно обогатили нестин-позитивную популяцию производных ЭСК культивированием в бессывороточной среде. Затем на клетки воздействовали ростовыми факторами - FGFb и никотинамидом. Были получены клетки, экспрессирующие основные гены эпителия эктодермального типа, однако количество инсулин положительных клеток составило всего 31,5%. Клетки in vitro организовывались в подобие островков Лангерганса и часть клеток которых продуцировала глюкагон и соматостатин. Были получены положительные результаты при трансплантации их животным с моделью сахарного диабета, однако по непонятным причинам публикации результатов дальнейших исследований не было.

Очевидно, что вопрос о получении гепатоцитов стоит не так остро как с р-клетками поджелудочной железы, ведь они способны делиться в зрелом состоянии и могут быть получены в ходе биопсии. Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы в клинике явно не покрывает существующие сегодня потребности и осуществляется лишь в нескольких центрах. Альтернативный метод клеточного трансплантационного лечения сахарного диабета 1-го типа - пересадка клеток костного мозга, пока не имеет вразумительного теоретического объяснения. Так, по данным различных исследователей трансдифференцировка клеток костного мозга в инсулин-продуцирующие клетки остается весьма спорной [7]. Несмотря на это, в отечественной практике данное направление уже используется клиницистами [8].

Разработка способов индукции направленной энтодермальной дифференцировки ЭСК животных и человека может привести к созданию не только методов коррекции различных патологий, но и стать одним из существенных аргументов в пользу продолжения исследований с этим материалом. Будущие исследования будут направлены на получение максимального количества дифференцированных клеток из ЭСК с чистотой приближающейся к 100%.

Схема строения зародыша млекопитающего на ранних стадиях развития [сагиттальный срез]:

1 - собственно зародыш; 3 - область будущей кишки; 3 - полость желточного мешка; 4 - область закладки сердца у краниального конца зародыша; 5 - кровяные островки; 6 - хорион По L.B. Агеу [1974], с изменениями

About the authors

R. V. Deev

Author for correspondence.
Email: redaktor@celltranspl.ru
Russian Federation

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Diagram of the structure of the mammalian embryo in the early stages of development [sagittal section]

Download (102KB)

Indexing metadata