Sravnitel'nyy analiz morfofunktsional'nykh svoystv postnatal'nykh mul'tipotentnykh stvolovykh i(ili) progenitornykh kletok-proizvodnykh nervnogo grebnya iz volosyanogo follikula i dermy kozhi

Full Text

Постнатальные мультипотентные стволовые/проге-ниторные клетки-производные нервного гребня (мСКНГ) имеют значительный потенциал для использования в регенеративной медицине. Одними из самых перспективных источников для изоляции постнатальных мСКНГ являются волосяной фолликул (ВФ) и дерма кожи (ДК) вследствие легкой доступности и малой инвазивности процедуры забора биоптата. Целью работы было провести изоляцию, крупномасштабную экспансию и составить сравнительную характеристику постнатальных мСКНГ из ВФ и ДК, полученных от тех же доноров. мСКНГ из ВФ были получены методом эксплантов. Для изоляции мСКНГ из дермы кожи была разработана оригинальная технология, основанная на комбинации ферментативной диссоциации, преплейтинга и культивирования в селективных ростовых условиях. Полученные культуры мСКНГ были охарактеризованы с использованием методов проточной цитометрии, кариотипирования, иммуноцитохимии, ПЦР в реальном времени и мультиплексного анализа продукции факторов роста и цитоки-нов. Также были определены: частота КОЕ, способность к самообновлению путем субклонирования клональных колоний, способность к сферогенезу и направленной мультилинейной дифференцировке. Постнатальные мСКНГ из ВФ и ДК были успешно получены во всех случаях от всех доноров (n = 10). Для получения клеток использовали 2 биоптата кожи 04 от каждого донора. В культуре in vitro мСКНГ из ВФ и ДК имели различную морфологию (удлиненная веретеновидная vs компактной полигональной), при этом обладали сходным иммунофенотипом - SO х 10+CD271+NESTIN+SOX2+CD73+CD90+CD105+CD 140a+CD140b+CD349+CD34-CD45-CD56-CD117-HLA-DR-. мСКНГ из дермы кожи показывали более высокую частоту КОЕ (34±3% vs 25±5% у мСКНГ ВФ), большую скорость пролиферации в 2D условиях (PDT 30,2±3,8 vs 34,4±8,0 ч) и при культивировании в 3D фибриновом геле (PDT 30,2±3,8 vs 34,4±8,0 ч). Необходимо отметить, что после крупномасштабной экспансии (до терапевтической дозы более 100 млн клеток) результирующая популяция мСКНГ из дермы кожи содержала большее относительное количество клеток, позитивных по SOx10, CD271, CD105, CD140a, CD146 и CD349 (р < 0,05). мСКНГ из обоих источников экспрессировали на схожем уровне следующие гены: OCT3/4, SOX2, KLF4, C-MYC, NANOG, S0x10, TFAP2A, LNGFR, NESTIN, SNAIL1, SNAIL2, TWIST1, VEGFA, FGF2, NGF, BDNF, GDNF, NTF3, и NTF4/5. Необходимо отметить, что мСКНГ экспрессировали гены, характерные для плюрипотент-ных клеток (0CT3/4, S0X2, KLF4, C-MYC и NAN0G) на значительно более низком уровне, чем ЭСК и иПСК человека. мСКНГ ВФ показывали значительно более высокий уровень экспрессии SOX9 по сравнению с мСКНГ из дермы кожи (р < 0,05). Также мСКНГ ВФ продуцировали большее количество следующих факторов роста, цитокинов и хемокинов: IL-6, iL-8, IL-16, sIL-2Ra, MCP-1, M-CSF и HGF (р < 0,05). В тоже время мСКНГ ДК показывали более высокую продукцию IL-3, CTACK, SDF-1a, GM-CSF, SCGF, VEGF-A, FGF-2 и NGF (р < 0,05). мСКНГ из обоих источников показывали схожую способность к направленной мультилинейной дифференцировке в нейроны, шван-новские клетки, меланоциты, адипоциты, остеобласты и хондроциты. Таким образом, ВФ и ДК являются пригодными тканевыми источниками для изоляции и последующей крупномасштабной экспансии постнатальных мСКНГ со схожими морфофункциональными свойствами. Однако необходимо отметить, что мСКНГ из дермы кожи демонстрируют более высокую скорость пролиферации при культивировании как в 2D, так и в 3D условиях, имеют более высокий клоногенный потенциал и формируют более гомогенную популяцию после крупномасштабной экспансии.

About the authors

Roman Gennad'evich Vasil'ev

Email: romanvasyliev8@gmail.com

Anzhela Evgen'evna Rodnichenko

Ol'ga Sergeevna Gubar'

Alena Vasil'evna Zlatskaya

Inna Mikhaylovna Gordienko

Natal'ya Mikhaylovna Todosenko

Svetlana Nikolaevna Novikova

Larisa Sergeevna Litvinova

Dmitriy Aleksandrovich Zubov

References

Supplementary files