Razrabotka metoda polucheniya i kharakteristika kletok kardiosfer

Abstract

Full Text

Разработка новых подходов к восстановлению поврежденного миокарда является одной из важнейших задач современной кардиологии. Однако разработка средств таргетного воздействия требует наличия моделей, которые с определенной долей допущения соответствуют специфическому клеточному микроокружению - «клеточным нишам» (КН), содержащим прогениторные и поддерживающие клетки, компоненты матрикса, сгруппированные в 3D условиях. Подобной 3D моделью КН сердца могут служить кардиосферы (КС). Цель: разработать метод получения и выполнить характеристику клеточного состава КС. В работе использованы образцы миокарда мышей C57Bl6. Для получения эксплантной культуры использовалась среда IMDM, содержащая 20% фетальной сыворотки теленка (ФСТ), глутамин, 2-меркаптоэтанол (МЭ), антибиотики; для сборки КС - комбинированная среда 35% IMDM/65% dMeM-F12, содержащая 3% ФСТ, глутамин, МЭ, EGF, bFGF, кардиотрофин-1, тромбин, B27 и антибиотики. Исследование иммунофенотипа проводили с помощью метода иммунофлуоресцентного окрашивания. Пролиферацию оценивали МТТ тестом, васкулогенные свойства - Tube assay. Показано, что культивирование образцов миокарда в виде эксплантной культуры с последующим сбором кардиосферообразующих клеток и их культивированием в соответствующих условиях способствует сборке КС. КС представляют собой 3D сфероиды с высоким уровенем компактизации, состоящие из клеток и белков внеклеточного матрикса. В центральной части КС локализуются клетки, экспрессирующие маркеры стволовых клеток Oct4 и c-kit, которые окружены клетками мезенхимального фенотипа (CD105+, CD73+) и сосудистыми/кардиальными клетками-пред-шественницами (Gata4+, Pecam+, SMA+). Пересадка сформированных КС в среду с высоким содержанием сыворотки способствует «разборке» КС и получению 2D гетерогенной культуры клеток. Эти клетки обладают клоногенностью и способностью к тубулогенезу при культивировании на чашках, покрытых Matrigel™. Тубулярные структуры окрашиваются на маркеры эндотелия, что свидетельствует об ангиогенном потенциале клеток КС. Культивирование клеток КС на чашках, покрытых коллагеном 1 типа или фибро-нектином, усиливает их пролиферативную активность. Возвращение клеток в среду для КС способствует повторной сборке 3D КС. Таким образом, нами разработан метод получения КС, которые имеют сходное строение с КН сердца, и могут быть использованы в качестве 3D модели для изучения их регуляции и тестирования фармакологических соединений.