Otsenka funktsional'noy aktivnosti belka cftr na modeli kishechnykh organoidov pri novykh i redkikh mutatsiyakh gena

Full Text

Введение. Кишечные органоиды (КО) - это самоорганизующиеся структуры из однослойного эпителия по клеточному составу и выполняемым клетками функциям идентичные слизистой кишечника. Они являются 3-D тканеподобной in vitro моделью длительного культивирования, на которой проводят оценку функции белка CFTR для персонализированной диагностики муко-висцидоза и изучения влияния таргетных препаратов. Известно более 2000 мутаций гена CFTR, большая часть из них редкие или даже уникальные. Форсколиновый тест на КО позволяет исследовать остаточную функцию белка CFTR при любых мутациях гена, в том числе редких или даже единичных, определить их патогенность. Степень набухания КО при стимуляции форсколином коррелирует с остаточной активностью канала CFTR. Кроме того, у органоидов с нарушенной функцией белка редуцирован размер внутренней полости (люмена). Цель исследования. Оценить функциональную активность канала CFTR у больных муковисцидозом с редкими генетическими вариантами гена CFTR c.3274T>C, a1083G>A и c.1735G>T. Материалы и методы. Культуры КО получали по стандартным протоколам из ректальных биоптатов пациентов с редкими генетическими вариантами CFTR и пациента с распространенным генотипом c.[ 1521 _1 523delCTT];[c.1521_1523delCTT] в качестве контроля. Для оценки остаточной функции канала CFTR КО окрашивали Calcein AM и обрабатывали 5 мкМ форсколина в течение 1,5 ч. Использовали таргетные препараты VX-809 (корректор) и VX-770 (потенциатор). Изображения получали с помощью микроскопа Observer.D1 (Zeiss). Результаты. Органоиды, полученные у пациентов с генетическими вариантами a1083G>A и c.1735G>T, в ответ на действие форсколина не изменяли морфологию - набухания или увеличения люмена не наблюдалось, что свидетельствует об отсутствии функционального канала CFTR. Для КО с мутацией a1083G>A было показано умеренное набухание при совместном воздействии VX-809 и форсколина (38±5,2%), что свидетельствует о частичном восстановлении активности CFTR корректором. Органоиды, полученные у пациента с мутацией c.3274T>C, имели сферическую форму, большой размер люмена, тонкие стенки и характеризовались высокой функциональной активностью CFTR. При этом VX-770 усиливал действие форсколина, а VX-809 не влиял на набухание. Результаты форсколинового теста показывают, что мутации a1083G>A и c.1735G>T являются «тяжелыми» патогенными и приводят к утрате функции канала CFTR, а мутация c.3274T>C не является клинически-значимой.

About the authors

Tat'yana Borisovna Bukharova

Email: bukharova-rmt@yandex.ru

Anna Sergeevna Efremova

Natal'ya Vadimovna Bulatenko

Yuliya Leonidovna Mel'yanovskaya

Nika Valentinovna Petrova

Nataliya Yur'evna Kashirskaya

Elena Kyastutisovna Zhekayte

Rena Abul'fazovna Zinchenko

Elena Ivanovna Kondrat'eva

Dmitriy Vadimovich Gol'dshteyn

References

Supplementary files