Comparative impact analysis of neuronal and glial progenitors conditioned medium on cerebellar neurons under glutamate exitotoxicity

Full Text

Введение Многочисленные исследования в области регенеративной медицины показали, что трансплантация различных типов клеток приводит к регенерации и восстановлению функций поврежденных тканей, в том числе при поражениях головного мозга [1]. Первоначально гипотезы о механизмах клеточной терапии основывались на прямом замещении поврежденных участков трансплантированными клетками [2]. Однако, в последнее время, все большую значимость приобретает пара-кринная гипотеза: синтезируемые клетками сигнальные молекулы могут быть столь же важными компонентами регенерации, как и непосредственная интеграция самих клеток [3]. Тем не менее, в настоящее время нет достаточно полного описания секреторной активности биологически активных молекул и механизмов их действия для большинства типов клеток. Нейродегенеративным заболеваниям сопутствует прогрессирующая гибель нервных клеток, ведущая к различным неврологическим симптомам. В отсутствии этиологического лечения важно замедлить течение заболевания путем обеспечения протекции нервной ткани. Одной из основных причин гибели клеток при ишемическом инсульте, а также нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера, является эксайтотоксичность - в результате гиперстимуляции NMDA-рецепторов усиливается ток ионов Ca2+ в клетку, что приводит к окислительному стрессу, повреждению митохондрий и в конечном итоге к клеточной гибели [4, 5]. Модель глутаматной эксайтотоксичности воспроизводит Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 47 этот процесс in vitro. Существует множество данных об эффективности применения кондиционированной среды, полученной при культивировании нейральных стволовых клеток, для терапии неврологических заболеваний, таких как ишемический инсульт [6] и спинальная травма мозга [7]. Было показано, что добавление в культуральную среду нейротрофического фактора мозга (BDNF), фактора роста нервов (NGF), цилиарного нейротрофического фактора (CNTF) и глиального нейротрофического фактора (GDNF) или их комбинации перед воздействием токсического агента способствует наибольшему нейропротекторному эффекту [8-11]. Целью данного исследования было изучение секреторной активности нейрональных и глиальных предшественников (НП и ГП) и влияния кондиционированных сред, полученных при их культивировании, на мозжечковые нейроны крыс в условиях глутаматной эксайтоток-сичности in vitro. Материал и методы Выделение мозжечковых нейронов У 6-8-сут. крысят линии Wistar производили декапитацию в соответствии с этическими требованиями по работе с животными. Извлеченный мозжечок 2-3 раза промывали в растворе Хенкса (ПанЭко, РФ) с добавлением 10% раствора HEPES (ПанЭко, РФ), измельчали и переносили в предварительно нагретый до 37°C 0,05% раствор трипсина с 0,02% ЭДТА (ПанЭко, РФ). После 15 мин. инкубации клеточную суспензию дважды промывали раствором Хенкса, клетки дезагрегировали до получения однородной суспензии и центрифугировали 2,5 мин. при 3000 об/ мин. Клеточный осадок ресуспендировали в соответствующем объеме культуральной среды Neurobasal Medium (Gibco, США), содержащей 2% добавки B27 (Gibco, США), 20 мМ KCl (Sigma-Aldrich, США), и переносили в лунки 12-луночных планшетов (Corning, США), предварительно покрытые поли^Б-лизином (ПанЭко, РФ) в концентрации 10 мкг/мл. В каждую лунку вносили по 2 мл клеточной суспензии, плотность посева составляла 2,5х105 кл./см2. Культуру мозжечковых нейронов инкубировали в течение 6-7 сут. (37°C, 5% СО2, относительная влажность 98%) для достижения необходимой экспрессии глутаматных рецепторов. На 2 сут. культивирования в среду добавляли 10 мкМ арабино-зинмоноцитозида (Sigma-Aldrich, США) для подавления пролиферации митотически активных клеток [12]. Получение кондиционированных сред при культивировании нейрональных и глиальных предшественников В работе использовали индуцированные плюрипо-тентные стволовые клетки (ИПСК), полученные из дермальных фибробластов человека с помощью набора для репрограммирования CTS CytoTune-iPS 2.1 Sendai Reprogramming Kit (Invitrogen, США). Для дифференци-ровки в нейральном направлении ИПСК культивировали в среде dMeM/F12 (Gibco, США) с добавлением 1% добавки N2 (Gibco, США), 2мМ глутамина (Панэко, РФ), 100 мг/л пенициллин-стрептомицина (Панэко, РФ), 10 мкМ SB431542 (Stemcell Technologies, США), 2 мкМ дорсоморфина (Stemcell Technologies, США) и 200 нМ LDN193189 (Sigma-Aldrich, США). Для диф-ференцировки в нейрональном направлении и получения культуры нейрональных предшественников нейральные стволовые клетки (НСК) культивировали в течение 2 недель в среде DMEM/F12 (Панэко, РФ), содержащей 2% добавки B27 (Gibco, США), 2мМ глутамина (Панэко, РФ), 100 мг/л пенициллин-стрептомицина (Панэко, РФ), 10 нг/мл FGF-2 (ProSpec, Великобритания) и 1 мкМ пурморфамина (Stemcell Technologies, США) [13, 14]. Для дифференцировки в глиальном направлении и получения культуры глиальных предшественников культивирование НСК проходило в 3 этапа, продолжительность каждого этапа 3 сут. На первом этапе к среде, содержащей стандартные компоненты: DMEM/F12, 1% добавки N2, 2мМ глутамина, 100 мг/л пенициллин-стрептомицина и 1% фетальной бычьей сыворотки (Панэко, РФ), добавляли 10 нг/мл FGF-2 и 20 нг/мл EGF (ProSpec, Великобритания). На втором этапе культивирования в среду к стандартным компонентам вносили 10 нг/мл FGF-2, 20 нг/мл EGF и 20 нг/мл CNTF (PeproTech, США), на третьем этапе - 20 нг/мл EGF и 20 нг/мл CNTF. [15, 16]. Для получения кондиционированных сред (КС) от нейрональных и глиальных предшественников - КС-НП и КС-ГП, клетки дважды промывали фосфатносолевым буфером, инкубировали в среде DMEM/ F1 2 (1 :1 ) 1 2 ч., полученную КС центрифугировали при 3000 об/мин. в течение 5 мин., супернатант отбирали и концентрировали с помощью 3 кДа мембран Amicon Ultra (Sigma-Aldrich, США) до конечной концентрации общего белка 500 мкг/мл. Моделирование глутаматной эксайтотоксичности Прединкубацию нейронов кондиционированными средами проводили, добавляя КС-НП или КС-ГП до конечной концентрации 5 мкг/мл общего белка за 1 сут. до моделирования глутаматной эксайтотоксичности. Для моделирования глутаматной эксайтотоксичности культуру мозжечковых нейронов промывали раствором DPBS без Ca2+ и Mg2+ (ПанЭко, РФ), клетки инкубировали 1 ч. в присутствии глутамата (200 мкМ) в буферном растворе следующего состава (мМ): NaCl - 140, KCl - 5, CaCl2 - 2, глицин - 10, HEPES - 20, глюкоза - 5, (рН 7,4) (Sigma-Aldrich, США), дважды промывали буфером, содержащим (мМ): NaCl - 140, KCl - 5, MgCl2 - 2, HEPES - 20, глюкоза - 5, (рН 7,4) (Sigma-Aldrich, США) и заливали исходной культуральной средой [17]. После инкубации с глутаматом получали культуры мозжечковых нейронов, обозначенные: КС-НП+Glu и КС-ГП+Glu. При длительном культивировании в течение 7 сут. КС-НП или КС-ГП добавляли каждые 48 ч. Результаты сравнивали с культурой мозжечковых нейронов, подвергшихся глутаматной эксайтотоксичности, но без внесения КС (культура Glu). Контролем являлась культура мозжечковых нейронов без добавления глутамата. Оценка гибели нейронов Гибель мозжечковых нейронов в культуре определяли через 24 ч. после добавления глутамата. Жизнеспособность оценивали с помощью морфометрического анализа и 2 колориметрических тестов: MTT ([4,5диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетразолийбромид) и ЛДГ (лактатдегидрогеназа). МТТ вносили в культуральную среду до конечной концентрации 0,5 мг/мл и инкубировали при 37°С в течение 2 ч. с последующим растворением кристаллов формазана в ДМСО (ПанЭко, РФ). Оптическую плотность измеряли при длине волны 570/620 нм на планшетном ридере (PerkinElmer, США). Результаты оценивали по отношению к контролю, который принимали за 100%. Активность фермента ЛДГ определяли с использованием коммерческого набора Lactate Dehydrogenase Activity Assay Kit (Sigma-Aldrich, США) согласно инструкции фирмы-производителя. Анализ основан на превращении лактата в пируват в присутствии ЛДГ с параллельным восстановлением Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 48 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НАД до НАДН, что приводит к изменению оптической плотности при 450 нм. Уровень высвобождения ЛДГ из клеток определяли по формуле: активность ЛДГ в супернатанте/(активность ЛДГ в супернатанте + активность ЛДГ в клеточном лизате) [18]. Для морфометрической оценке гибели нейронов исследовали ядерную фрагментацию (апоптоз): прижизненное окрашивание в течение 30 мин. флуоресцентным красителем Hoechst33342 в концентрации 5 мкг/ мл и витальным красителем 0,5 мкМ Calcein-AM (процент живых клеток). Количество некротических клеток определяли с помощью 10 мин. окрашивания 1 мкг/ мл йодида пропидия (IP). С использованием люминесцентного инвертированного микроскопа Axio Observer. D1 с камерой AxioCam HRc (Carl Zeiss, Германия) для каждого образца снимали по 8-10 случайным образом выбранных полей, которые подвергали морфометрическому анализу. Процент апоптотических и некротических клеток рассчитывали исходя из общего числа клеток в соответствующей лунке (образце). Средние значения получали из данных анализа 3-4 образцов. ПЦРанализ мРНК выделяли с помощью коммерческого набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) согласно инструкции производителя, по стандартному протоколу RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, США) синтезировали кДНК. Для ПЦР в режиме реального времени использовали готовую реакционную смесь c интеркалирующим красителем Sybr Green, амплификация осуществлялась в термоциклере BioRad iQ cycler. Схема реакции: первичная денатурация 95°C, 5 мин.; денатурация 95°C, 20 сек.; отжиг праймеров 55-63°C, 20 сек.; элонгация 72°C, 20 сек. (40 циклов). Уровень мРНК анализируемых генов выравнивали по отношению к усредненным данным амплификации 2 генов домашнего хозяйства: GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа) и ActB (р-актин). Относительное количество мРНК рассчитывали с помощью АС (Т) метода. С применением программы NCBI Primer-Blast были подобраны праймеры, используемые в качестве затравок к исследуемым генам: BAX forward TTGTGGCTGGAGTCCTCACT, reverse TTTCCCCGTTCCCCATTCATC; BCL-2 forward GGGGCTAC-GAGTGGGTACT, reverse GACGGTAGCGACGAGAGAAG; MAP-2 forward AGTGTCTGCAAGGATAGTTCAAG, reverse AGGCTGATCCTTGTGTTGGG; GAP-43 forward AAGGAT-GATGCTCCCGTTGC, reverse CGGCCTTTTCCTCTGAAGGG; ActB forward GAGATTACTGCCCTGGCTCC, reverse GCT-CAGTAACAGTCCGCCTA; GAPDH forward GCGAGATCCC-GCTAACATCA, reverse CCCTTCCACGATGCCAAAGT. Иммуноцитохимический анализ Для иммуноцитохимического анализа культуры мозжечковых нейронов фиксировали 4% раствором формальдегида (Merck KGaA, Германия) 10 мин. при комнатной температуре, пермеабилизовали 0,25% раствором Тритона Х-100 (Sigma-Aldrich, США) в течение 30 мин. и обрабатывали первичными антителами к p-III-тубулину TUBB3 (1:500); глиальному фибриллярному кислому белку GFAP (1:600); белку, ассоциированному с микротрубочками MAP2 (1 :400); кальций связывающему белку S100b (1:100); протеогликану TRA-1-81 (1:200); транскрипционному фактору Nanog (1:350); панцитокератину (1:600); десмину(1:900); а-фетопротеину (1:650) (Abcam, Великобритания) в течение ночи при +4°C. Далее клетки инкубировали в темноте 60 мин. с вторичными антителами, меченными флуорохром - anti-mouse Alexa Fluor 555 (1:600) или anti-rabbit Alexa Fluor 488 (1:600) (Invitrogen, США). Ядра докрашивали 1 мкг/мл DAPI (4,6- диамино-2-фенилиндол дигидрохлорид, Sigma-Aldrich, США) в фосфатно-солевом буфере. Изображения получали с помощью инвертированного люминесцентного микроскопа Axio Observer.D1 с камерой AxioCam HRc (Carl Zeiss, Германия). Иммуноферментный анализ (ИФА) Для исследования секреции нейротрофинов BDNF, СNTF, GDNF и NGF в кондиционированных средах от нейрональных и глиальных предшественников был проведен ИФА в соответствии с инструкцией производителя (Cloud-Clone corp., КНР). Оптическую плотность измеряли на планшетном ридере (PerkinElmer, США) при длине волны 450 нм. Статистический анализ Обработку данных выполняли в программе SigmaPlot 12.5. Для анализа использовали данные 3-5 независимых экспериментов. Различия считали достоверными при p<0,05. Результаты Характеристика культуры мозжечковых нейронов На 7 сут. после выделения первичной культуры мозжечковых нейронов получали смешанную нейроглиальную культуру, состоящую, в основном, из нейрональных клеток. Морфологически нейроны были легко отличимы от глии (рис. 1А). Тела нейронов имели округлую форму с разветвленной сетью нейритов и окрашивались антителами к TUBB3. Глиальные клетки имели неровный контур с короткими отростками и синтезировали астро-цитарный маркер GFAP (рис. 1 Б) Характеристика ИПСК, нейрональных и глиальных предшественников На протяжении двух недель после репрограммирования менялась морфология фибробластов, что свидетельствовало об инфицировании клеток вирусом Сендай. Через три недели после трансдукции начали образовываться колонии клеток, схожих по морфологии с колониями эмбриональных стволовых клеток человека (рис. 2А). Колонии имели ровные края и плотные контакты между клетками. Полученные линии ИПСК окрашивались на маркеры плюрипотентности Nanog и TRA-1-81 (рис. 2Б), формировали эмбриоидные тельца, при спонтанной дифференцировке образовывали три зародышевых листка - эктодерму, мезодерму, и энтодерму (рис. 2 В, Г, Д). Нейрональные предшественники, дифференцированные из ИПСК, представляли собой клетки небольшого размера с отростком (отростками), по длине не превышающим трех диаметров тела (рис. 3А). Количество TUBB3+-клеток в культуре составляло 98±2% (рис. 3Б). Глиальные предшественники, дифференцированные из ИПСК, представляли собой отростчатые, веретенообразные или распластанные клетки размером около 20 мкм (рис. 3В). Глиальные предшественники преимущественно синтезировали астроцитарный маркер S100b: количество таких клеток в культуре составляло 97±3% (рис. 3Г). Оценка жизнеспособности клеток культуры мозжечковых нейронов С помощью МТТ- и ЛДГ-тестов было установлено, что через 24 ч. после инкубации мозжечковых нейронов крысы в присутствии 200 мкМ глутамата число жизнеспособных нейронов снижалось на 51,4±4,075%, а количество некротических клеток увеличивалось на 23±2,36% по сравнению с контролем (рис. 4А, Б). Прединкубация нейронов в течение 1 сут. с КС-ГП приводила к увеличению Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 49 Рис. 1. Культуры мозжечковых нейронов: А - общий вид культуры клеток; Б - экспрессия клетками TUBB3 (красный) и GFAP [зеленый]. Ядра клеток докрашены DAPI (синий). А - световая микроскопия, б - иммуноцитохимическая реакция с антителами к TUBB3 и GFAP. Масштабный отрезок - 100 мкм Рис. 2. Культуры ИПСК: А - общий вид культуры ИПСК; Б - экспрессия культурой ИПСК маркеров плюрипотентности: TRA-1-81 (красный), Nanog (зеленый), ядра клеток докрашены DAPI (синий); В, Г, Д - спонтанная дифференцировка ИПСК в эмбриоидных тельцах: В - экспрессия эпителиального маркера панцитокератина (эктодерма), Г - экспрессия мезодермального маркера десмина, Д - экспрессия энтодермального маркера а-фетопротеина. Ядра клеток докрашены DAPI (синий). А - световая микроскопия, Б-Д - иммуноцитохимическая реакция с антителами к указанным маркерам. Масштабный отрезок - 100 мкм количества жизнеспособных клеток на 26±5,01% и снижению высвобождения ЛДГ на 14,083*3,66%, что статистически достоверно отличалось от данных культуры Glu. Подобного эффекта не было обнаружено при добавлении КС-НП в той же концентрации. Для подтверждения жизнеспособности мозжечковых нейронов исследовали экспрессию генов BAX и BCL2, являющихся негативными и позитивными регуляторами апоптоза. Спустя 1 сут. после моделирования глутаматной эксайтотоксичности уровень мРНК гена BCL2 понизился в 5 раз, а уровень мРНК гена BAX повысился в 3,5 раза по сравнению с контролем. Прединкубация с КС-ГП снижала экспрессию гена BAX в 2,3 раза и увеличивала экспрессию гена BCL2 в 3,7 раза по сравнению с культурой Glu. Значимых различий в экспрессии генов BAX и BCL2 между культурами КС-НП+Glu и Glu обнаружено не было (рис. 5). Количество некротических и апоптотических клеток Воздействие глутамата приводило к увеличению количества апоптотических клеток в 3,3 раза, а некротических - в 11 раз по сравнению с контролем. Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 50 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Рис. 3. Культуры нейрональных и глиальных предшественников, полученных из ИПСК: А - общий вид клеток ГП; Б - экспрессия маркера глиальных предшественников S100b (красный); В - общий вид клеток НП; Г - экспрессия маркера нейрональных предшественников TUBB3 (красный). Ядра клеток докрашены DAPI. А, В - световая микроскопия, б, Г - иммуноцитохимическая реакция с антителами к указанным маркерам. Масштабный отрезок - 100 мкм Рис. 4. Жизнеспособность клеток культуры мозжечковых нейронов: А - МТТ-тест; б - ЛДГ-тест. ***p<0,001 по сравнению с культурой Glu; ###p<0,001 по сравнению с культурой КС-НП+Glu Прединкубация культивируемых мозжечковых нейронов крыс с КС-ГП способствовала снижению количества апоптотических клеток в 1,5 раза и некротических - в 3,6 раза. значимых различий в количестве некротических и апоптотических клеток между культурами КС-НП+Glu и Glu обнаружено не было (рис. 6). Нейротрофический эффект Степень повреждения нейритов и способность нейронов к репаративным процессам оценивали по экспрессии маркеров нейритогенеза MAP2 и GAP43, участвующих в росте аксонов и дендритов, пластичности и регенерации. При глутаматной эксайтотоксичности Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 51 Рис. 5. Экспрессия генов BAX и BCL2. ПЦР-анализ в режиме реального времени: ***p<0,001 по сравнению с культурой Glu; ###p<0,001 по сравнению с культурой КС-НП+Glu Рис. 6. Количество апоптотических и некротических клеток в культуре мозжечковых нейронов: **p<0,01, ***p<0,001 по сравнению с культурой Glu; ##p<0,01, ###p<0,001 по сравнению с культурой КС-НП+Glu на протяжении всего эксперимента наблюдали дегенеративные процессы в нейритах. Морфологически в мозжечковых нейронах аксоны и дендриты не были выявлены (рис. 7А). В контроле, без воздействия глутамата, наблюдали клетки с длинными отростками, которые хорошо окрашивались антителами к TUBB3 и МАр2. Уровень экспрессии генов MAP2 и GAP43 снижался в течение всего эксперимента более чем в 2 раза, различия были статистически достоверны по сравнению с контролем. Прединкубация и дальнейшее культивирование в течение 7 сут. с добавлением КС-ГП приводили к восстановлению нейритов: уровень экспрессии гена MAP2 увеличился в 2,3 раза, гена GAP43 - в 2 раза по сравнению с культурой Glu. При этом, морфологический анализ показал наличие аксонов и дендритов, положительно окрашенных антителами к TUBB3 и МАр2. значимых различий в строении нейронов и экспрессией генов MAP2 и GAP43 между культурами КС-НП+Glu и Glu не было обнаружено (рис. 7Б, В). Секреция нейротрофинов По данным ИФА, наибольшая секреция нейротрофинов была обнаружена у глиальных предшественников (табл.): уровень секреции BDNF в 19 раз, NGF в 12 раз, CNTF в 18 раз и gDnF в 3 раза был выше в КС-ГП, чем в КС-НП. Таблица. Секреция нейротрофинов Нейротрофины НП ГП BDNF, пг/мл 6,433±1,151 123,228±7,922 CNTF, пг/мл 10,595±3,185 185,885±14,446 GDNF, пг/мл 27,705±4,628 80,029±5,150 NGF, пг/мл 4,289±0,907 52,260±9,004 Обсуждение В настоящей работе впервые было проведено сравнение паракринного влияния КС-ГП и КС-НП, полученных из ИПСК, в условиях глутаматной эксайтотоксичности, а также секреции ими нейротрофинов. Как оказалось, наиболее выраженным паракринным действием обладают глиальные предшественники. КС-ГП оказывала нейропро-тективное и нейротрофическое действие на мозжечковые нейроны крыс. Внесение КС-ГП в культуральную среду увеличивало жизнеспособность нейронов, обеспечивая антинекротическое и антиапоптотическое действие, в том числе за счет активации сигнальных путей, приводящих к повышению экспрессии гена BCL2 и подавлению экспрессии гена BAX. Культивирование с КС-ГП в течение 7 сут. способствовало регенерации аксонов и дендри-тов, увеличению уровня экспрессии генов - маркеров нейритогенеза MAP2 и GAP43. Напротив, добавление КС-НП не влияло на жизнеспособность нейронов в культуре и не способствовало регенерации и росту нейритов при длительном культивировании. различия могут быть обусловлены более высокой секрецией глиальными предшественниками биомолекул, обладающих нейропро-тективными и нейротрофическими свойствами. Известно, что при взаимодействии нейротрофинов BDNF, NGF, GDNF со своими рецепторами trkB, trkA, NGFR, GFRa1 происходит активация сигнальных путей Ras/MAPK(ERK) и PI3K/ Akt, которые запускают экспрессию генов, отвечающих за выживание нейрональных клеток [19-22]. ранее было обнаружено положительное влияние секретома (кондиционированной среды) мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (КС-ММСК) жировой ткани на нейропротекцию клеточной линии PC12 при глутаматной эксайтотоксичности. [23]. В другом исследовании на той же клеточной линии была продемонстрирована способность КС-ММСК индуцировать нейритогенез [24]. Также было выявлено нейропротекторное действие КС-ММСК жировой ткани на мозжечковые нейроны путем регулирования энергетического обмена [25, 26]. A. Wilkins с соавт. (2009) доказали, что инкубация кортикальных нейронов с секретомом ММСК костного мозга значительно увеличивает их выживаемость путем ингибирования апоптоза. [27]. В связи с вышесказанным, возникает вопрос о выборе типа клеток как для непосредственно клеточной терапии, так и для получения КС. Способность глиальных и нейрональных предшественников к дифференцировке в зрелые нейроны и астроглию и секреции нейротрофических факторов, характерных для ранних этапов формирования ЦНС, делают эти культуры более подходящим объектом для клеточной терапии по сравнению с ММСК. Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 52 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Рис. 7. Экспрессия маркеров, регулирующих процессы нейритогенеза: А -экспрессия MAP2 (зеленый) и TUBB3 [красный], 7 сут. культивирования; ядра клеток докрашены DAPI (синий). Иммуноцитохимическая реакция с антителами к указанным маркерам. Масштабный отрезок - 100 мкм. Б, В - экспрессия генов MAP2 и GAP43. ПЦР-анализ в режиме реального времени: *p<0,05, **p<O,0l, ***p<0,001 по сравнению с культурой Glu; #p<0,05 по сравнению с культурой КС-НП+Glu глиальных предшественников являются обоснованием для их дальнейшего изучения. Добавление потенциального протектора до моделирования повреждения соответствует профилактическому лечению in vivo, которое не применимо при острых состояниях, но может быть использовано для реабилитации или терапии прогрессирующих нейродегенеративных заболеваний. Полученные результаты о нейропротективных и нейротрофических свойствах

About the authors

D. I Salikhova

N.P. Bochkov Medical Genetic Research Center; Research Institute of Human Morphology

Email: diana_salikhova@bk.ru
Moscow, Russia

G. E Leonov

N.P. Bochkov Medical Genetic Research Center

Email: diana_salikhova@bk.ru
Moscow, Russia

T. B Bukharova

N.P. Bochkov Medical Genetic Research Center

Email: diana_salikhova@bk.ru
Moscow, Russia

Z. V Kornienko

N.P. Bochkov Medical Genetic Research Center

Email: diana_salikhova@bk.ru
Moscow, Russia

N. V Bulatenko

N.P. Bochkov Medical Genetic Research Center

Email: diana_salikhova@bk.ru
Moscow, Russia

A. S Efremova

N.P. Bochkov Medical Genetic Research Center

Email: diana_salikhova@bk.ru
Moscow, Russia

O. V Makhnach

N.P. Bochkov Medical Genetic Research Center

Email: diana_salikhova@bk.ru
Moscow, Russia

A. V Makarov

Research Institute of Human Morphology

Email: diana_salikhova@bk.ru
Moscow, Russia

AV. V Elchaninov

Research Institute of Human Morphology

Email: diana_salikhova@bk.ru
Moscow, Russia

T. H Fathudinov

Research Institute of Human Morphology; Peoples' Friendship University of Russia

Email: diana_salikhova@bk.ru
Moscow, Russia

D. V Goldshtein

N.P. Bochkov Medical Genetic Research Center; Peoples' Friendship University of Russia

Email: diana_salikhova@bk.ru
Moscow, Russia

References

Supplementary files