Otsenka spetsificheskoy aktivnosti konditsionirovannoy sredy, poluchennoy v protsesse differentsirovki msk cheloveka v osteogennom napravlenii

Abstract

Full Text

Изучение специфической активности секретома мезенхимных стволовых клеток (МСК) может представлять как фундаментальный, так и прикладной интерес. Целью настоящей работы являлась оценка влияния на адгезионные, пролиферативные и дифференцировочные свойства кондиционированной среды (КС), полученной в процессе культивирования МСК человека, направленных в остеогенную дифференцировку. Клетки линии FetMSC (выделены из МСК костного мозга эмбриона человека, предоставлены РККП, ИНЦ РАН, Санкт-Петербург) культивировали с использованием роботизированной станции Compact Select T (Sartorius). Клетки культивировали в питательной среде с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки до клеточной массы 7х108 клеток, затем инкубировали в остеогенной и бессывороточной средах. После сбора наработанной клетками КС она была от-центрифугирована, профильтрована и сконцентрирована. Полученный концентрат (ККС) подвергали диализу, высушивали и растворяли в бессывороточной среде ДМЕМ (Росмедбио, РФ). Исследовали активность ККС при разведении его в 50 (0,66 мг/мл) и 100 (0,33 мг/мл) раз. Влияние ККС на адгезионные свойства FetMSC регистрировали после окраски цитоскелета клеток родамин-фаллоиди-ном. Было выявлено усиление степени распластанности клеток через 2 ч инкубации по сравнению с контролем - в присутствии 0,33 мг/мл ККС клетки были распластаны в 3 раза больше, 0,66 мг/мл - почти в 4 раза. Пролиферативная активность FetMSC через 7 сут. инкубации в присутствии ККС (обеих концентраций) соответствовала уровню значений в контроле (MTT-тест). Также было выявлено, что в присутствии ККС (0,66 мг/ мл) без добавления остеоиндуктивных факторов МСК направляются в остеогенную дифференцировку. Так, с помощью конфокальной микроскопии было обнаружено превышение значений флуоресценции для факторов транскрипции Runx2, Osterix и YAP1 после 14 сут. культивирования по сравнению с контролем. Значения окраски на щелочную фосфатазу в клетках на 7 сут. была сравнима, а на 14 сут. - значительно превышала значения, полученные для положительного контроля. Уровень накопления ионов кальция в цитоплазме клеток на 14 сут. культивирования был одинаковым с положительным контролем. Таким образом, экспериментальный образец ККС, полученный в процессе дифференцировки линии МСК человека в остеогенном направлении, обладает адгезионной, пролиферативной и остеоиндуктивной активностью.