Razrabotka sistemy vizualizatsii ekspressii gena GFAP - spetsificheskogo markera astrotsitov

Abstract

Full Text

Исследование астроглиальных клеток представляет большой интерес при изучении процессов нейродегенерации и нейропластичности. Клетки астроглии выполняют важные функции в гомеостазе нейронов и регуляции синаптической пластичности, влияют на выброс про-апоптотических факторов. Для изучения механизмов взаимодействия астроглии с нейронами in vitro важным условием является получение чистых популяций целевых типов клеток. Несовершенство протоколов диффе-ренцировки ИПСК приводит к незначительному выходу релевантных типов клеток. Решением этой проблемы может стать отбор целевых клеток с использованием интегрированных в геном флуоресцентных репортеров, которые помогают осуществлять визуализацию экспрессии специфических генов-маркеров. Ранее нами была получена линия ИПСК, в которой репортерный ген RFP маркировал экспрессию астроцит-специфичного гена GFAP. ОТ-ПЦР анализ выявил наличие РНК-продукта гена RFP в дифференцированных производных, однако свечение флуоресцентного белка не регистрировалось. Вероятно, это связано с низкой активностью промотора гена GFAP, недостаточной для визуализации свечения RFP при помощи флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии. В настоящей работе проведена оптимизация системы визуализации экспрессии целевого гена. В локус AAVS1 при помощи системы CRISPR/Cas9 внесли репортерную конструкцию LoxP-GFP-LoxP-RFP под контролем конститутивного промотора Pgk1. Непосредственно за маркерным геном GFAP через 2А-пептид помещена последовательность гена Cre-рекомбиназы. В отсутствии активности гена GFAP в клетках экспрессируется белок GFP. После активации GFAP в клетках нарабатывается Cre-рекомбиназа, обеспечивающая удаление последовательности гена GFP вместе со стоп-кодоном из генома. В результате активируется ген RFP, и клетки приобретают красное свечение. Активность репортерной системы подтверждена на клетках линии НЕК293А, в геном которой внесли конструкцию LoxP-GFP-LoxP-RFP. Временная экспрессия Cre-рекомбиназы осуществлялась с плазмиды pCAG-Cre:GFP (Addgene #13776). Для подтверждения работы созданной нами системы визуализации необходима интеграция обоих трансгенов в геном ИПСК и проведение направленной дифференцировки. Система позволит выявить наличие астроглиальных производных в смешанной популяции дифференцированных клеток человека.