Kletki pigmentnogo epiteliya setchatki cheloveka IN VITRO proyavlyayut sposobnost' k neyral'noy differentsirovke

Abstract

Full Text

Ретинальный пигментный эпителий (РПЭ) образуется из одной нейроэпителиальной закладки с нейронами сетчатки, благодаря этому клетки РПЭ могут быть использованы для терапии сетчатки после повреждений. В определенных условиях РПЭ может проявлять пластичность, меняя свой путь дифференцировки. Так, РПЭ низших позвоночных способен репрограммироваться в мультипотентные клетки, способные дифференцироваться во все типы клеток сетчатки и полностью восстанавливать её после повреждений (Grigoryan, 2015). Одним из ключевых факторов де- и трансдифференцировки является основной фактор роста фибробластов (bFGF). Целью работы было исследовать возможности к нейральной дифференцировке клеток РПЭ человека под влиянием bFGF. В работе была использована линия клеток РПЭ человека ARPE-19. Культивирование осуществляли в среде DMEM/F-12, дополненной 10% ЭТС, L-глутамином, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при 37°С и 5% СО2. Пассирование клеток проводили смесью растворов 0.25% трипсина и 0.48 мМ версена в соотношении 1:3. Для оценки действия bFGF добавляли в количестве 20 нг/мл в ростовую среду того же состава, но с разным содержанием ЭТС (0 или 1%). Контролем служили клетки, культивированные без bFGF. Для оценки дифференцировки использовали иммуноцитохимическое окрашивание и ПЦР в реальном времени. Оценку пролиферативной активности клеток проводили с помощью МТТ-теста. Данные иммуноцитохимического анализа выявили понижениие эпителиальной и начало нейрональной дифференцировки ARPE-19 под действием bFGF. По мере культивирования снижалась интенсивность окрашивания на Сх43 (ключевой белок щелевых контактов, играющий важную роль в дифференцировке РПЭ) и увеличивалась интенсивность окрашивания на TUBB3 (маркер ранней фазы дифференцировки нейронов сетчатки: колбочек, горизонтальных, ама-криновых и ганглиозных клеток), в том числе в клетках с аксоноподобными отростками. Через 120 ч. Сх43-окрашивание определялось на поверхности лишь небольшого числа клеток. Около 20% клеток Гены & Клетки Том XII, № 3, 2017 268 материалы III национального конгресса по регенеративной медицине приобрели нейроноподобную морфологию и длинные аксоноподобные отростки, дающие выраженное положительное окрашивание на маркеры нейральной дифференцировки. ПЦР в реальном времени подтвердил данные иммуноцитохимического исследования. Впервые показано, что после добавления bFGF в клетках РПЭ резко возрастала экспрессия мРНК гена плюрипотентности KLF4, которое сопровождалось значимым падением экспрессии PAX6, MITF и OTX2, что свидетельствовало о дедифференцировки РПЭ. С течением времени уровень экспрессии мРНК KLF4 снижался, что сопровождалось трехкратным ростом экспрессии мРНК TUBB3, и одновременно возвратом экспрессии PAX6, MITF и OTX2 к базовому уровню. Проведенное исследование показало, что bFGF имеет двойственное влияние на ARPE-19: активировать мультипотентный статус клеток, а затем направлять их по пути нейральной дифферен-цировки.