Poluchenie mezenkhimnykh stvolovykh kletok cheloveka, geneticheski modifitsirovannykh genami-supressorami opukholevykh kletok i analiz ekspressii rekombinantnykh belkov IN VITRO

Abstract

Full Text

Цитокины представляют собой молекулярные мессенджеры, позволяющие клеткам иммунной системы взаимодействовать друг с другом. Цитокины непосредственно стимулируют иммунные эффек-торные и стромальные клетки, тем самым регулируя развитие опухоли и ее микроокружения. Многочисленные in vitro и in vivo исследования показали, что цитокины обладают широкой противоопухолевой активностью. В ряде исследований показана эффективность использования различных комбинаций ци-токинов друг с другом и с рядом противоопухолевых препаратов для подавления роста опухоли in vivo. Известным онкосупрессором является фосфатаза с двойной субстратной специфичностью, продукт гена PTEN. Делеция данного гена часто наблюдается в различных типах опухолей человека. Мезенхимные стволовые клетки (МСК) обладают иммунологической инертностью и естественным тропизмом к местам локализации опухолей, что делает их перспективными векторами для целевой доставки противоопухолевых агентов. В настоящей работе получены линии МСК из жировой ткани человека со сверхэкспрессией генов TRAIL (лиганд семейства фактора некроза опухоли, индуцирующий апоптоз), IFNA17 (интерферона альфа 17), IL2 (интерлейкин 2), GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) и PTEN. На первом этапе работы проводили субклонирование целевых генов из вектора-донора pDONR221 в лентивирус-ный плазмидный вектор pLX303 (Addgene) методом LR-рекомбинации по технологии Gateway (In vitrogene, США). Продуктами рекомбинации трансформировали компетентные клетки Escherichia coli. Методом ПЦР-скрининга колоний с использованием ген-специфичных праймеров отбирали положительные клоны и выделяли из них плазмидную ДНК. Правильность сборки плазмидных конструкций была проанализирована рестрикционным анализом с эндонуклеазами рестрикиции KpnI и XhoII (ThermoFisherScientific, США) и секвенированием. Рекомбинантные лентивирусы были получены путем ко-трансфекции пакующей линии клеток HEK293FT и сконцентрированы ультрацентрифугированием при 26 000 об/мин. Вирусный титр определяли методом проточной цитофлуориметрии по флуоресценции контрольных клеток, трансдуцированных лентиви-русом, кодирующим ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). МСК из жировой ткани человека были модифицированы рекомбинантными лентивирусами, кодирующими гены IFNA17, TRAIL, PTEN, GM-CSF, IL-2 и gfp с множественностью инфекции (MOI) 10. После генетической модификации была проведена селекция трансдуцированных клеток путем культивирования с антибиотиком бластицидин S в концентрации 5 мкг/мл в течение 10 дней. Сверхэкспрессия целевых генов в МСК после селекции была подтверждена с помощью ПЦР-РВ. В дальнейшем планируется исследование противоопухолевой активности МСК со сверхэкспрессией IFNA17, TRAIL, PTEN, GM-CSF и IL-2 в культуре опухолевых клеток in vitro и in vivo.