Full Text
ВВЕДЕНИЕ. Клеточная терапия в офтальмологии перестает быть фантастическим будущим, клеточные модели занимают свою нишу в исследовательских работах. Материалом служат как иммортализо-ванные клеточные линии, так и первичные культуры, свойства которых наиболее близко соотносятся со статусом клеток in vivo. Широкое распространение технологий трансплантации роговицы делает относительно доступным биологический материал, из которого возможно получить первичные клеточные культуры. Задачей исследования было показать возможность получения клеточного материала из доступного послеоперационного и охарактеризовать его по ряду параметров. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ. Корнеосклеральные диски были получены из лаборатории консервации тканей ФГБНУ «НИИГБ». Образцы измельчали на фрагменты 2x2 мм и помещали в культуральный флакон (Corning) с площадью поверхности 25см2. Использовали ростовую среду DMEM/F12 (Gibco) с 10% сыворотки, культивировали в стандартных условиях. После миграции из фрагментов пассировали клетки с коэффициентом 1:4 с использованием 0.25% Trypsin-EDTA (Gibco). Морфометрический анализ проводили с использованием программы ImageJ. Иммуноцитохимический анализ проводили для выявления специфичного для зрелого эпителия роговицы цитокератина 3 (Abcam, 1:750), для ЛСК -цитокератина 19 (Abcam, 1:20), для стромальных кератоцитов - виментина (Abcam, 1:750), для лим-бальных МСК - CD90 (MilteniBiotech, 1:11). Вторичные антитела были с меткой Alexa555 (In vitrogen, 1:500), ядра докрашивали DAPI (In vitrogen, 1:400). Съемку проводили на микроскопах NikonA1 MP и ZeissAxioVert.A1. Для формирования многослойной клеточной системы клетки стромы роговицы выращивали на пористой мембране культуральных вкладок (ThinCert™ CellCultureInserts). Сканирую щая электронная микроскопия с лантаноидным контрастированием была проведена после применения набора реактивов «BioREE» (ООО Глаукон, Россия). Съемку вели на EVOLS10, (ZEISS, Германия) в режиме EP (70 Па) при ускоряющем напряжении 27 кВ. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Клетки мигрировали из эксплантов и адгезировали к пластику, демонстрируя характерное для ЛСК и Л-МСК коло-ниеобразование. В результате работы получена культура лимбального эпителия роговицы, стромальных фибробластов роговицы, смешанная культура ЛСК/ ЛМСК. Морфометрический анализ показал характерные для этих типов клеток параметры. Подтвердили наличие цитокератина 3 в полученных эпителиоци-тах, виментина в стромальных кератоцитах, маркеров стволовости (CK19 и CD90) в смешанной культуре ЛСК/ЛМСК. При культивировании кератоцитов на вкладках, ко второй неделе клетки сформировали многослойную систему толщиной 5-7 мкм, применимую для изучения патологии стромы, в частности -изучения биомеханики, что подтвердили исследования вязкопластических свойств полученной конструкции. Таким образом, показано, что полученные первичные клеточные культуры применимы для дальнейших исследований, как терапевтического плана, так и фундаментального.
