Razrabotka genoterapevticheskoy plazmidnoy konstruktsii, kodiruyushchey faktor rosta gepatotsitov (HGF) i faktor rosta endoteliya sosudov (VEGF165)

Abstract

Full Text

Одним из перспективных направлений регенеративной медицины является генная терапия для экспрессии ангиогенных факторов роста с целью лечения сердечно-сосудистых заболеваний - «терапевтический ангиогенез». Ранее в нашей лаборатории было показано, что введение смеси плазмид, кодирующих VEGF165 и HGF, приводит к восстановлению кровотока в ишемизированной конечности мыши, при этом эффективность ангиогенеза была выше, чем при введении каждой плазмиды по отдельности. Существенными недостатками введения смеси векторов является низкая вероятность ко-трансфекции клеток двумя плазмидами, различия экспрессии вводимых генов и снижение эффективности их совместного действия. Для ко-экспрессии двух и более генов разрабатываются мультицистронные конструкции, например, векторы, включающие внутренние сайты посадки рибосом (IRES). Плазмиды, несущие IRES, позволяют осуществлять одновременную экспрессию нескольких генов, однако, эффективность трансляции, обеспечиваемой IRES, обычно существенно уступает кэп-зависимой инициации, а конечное соотношение концентраций синтезируемых белков варьирует в зависимости от выбранного IRES. В настоящее время наиболее часто используется IRES вируса энцефаломиокардита (EMCV). На основе вектора pVAX нами были созданы конструкции VEGF-IRES_EMCV-HGF (VIH) и HGF-IRES_ EMCV-VEGF (HIV). Для оценки продукции VEGF1 65 и HGF клетки HEK293 трансфицировали кальций-фосфатным способом, концентрации VEGF165 и HGF в клеточной среде оценивались методом ИФА. При трансфекции клеток плазмидой VIH не наблюдалась продукция HGF, поэтому было решено отказаться от использования данного вектора. Соотношение молярных концентраций HGF/VEGF165 после трансфекции плазмидой HIV составило около 23:1. Дальнейшая работа заключалась в оптимизации вектора HIV, для чего нами были сконструированы несколько вариантов плазмид. На основе литературных данных для использования в новых векторах были выбраны IRES белков эукариот: Bip, FGF1 и elF4G. Анализ эффективности плазмид проводился аналогично. Молярные концентрации HGF и VEGF165 различались в 42,5 и 26,5 раз при использовании плазмид с IRES белков Bip и FGF1 соответственно. При трансфекции клеток вектором с IRESelF4G синтезировались плохо детектируемые количества обоих белков. Как и в случае с использованием вирусного IRES, наблюдалась низкая продукция VEGF165, поэтому плазмиды с IRESEMCV, а также с IRES белков Bip и FGF1 были модифицированы путем замены последовательно сти VEGF165 на VEGFopt с оптимизированной последовательностью Козак. Результаты ИФА показали, что оптимальным для использования является вектор HGF-IRES_EMCV-VEGFopt: при трансфекции им синтезировались достаточно высокие концентрации целевых белков, при этом соотношение их молярных концентраций составляло около 5:1 в отличие от 15-40:1 при использовании конструкций с иными тестированными IRES. Дальнейшая работа будет заключаться в оценке биологической активности выбранного вектора и разработке на его основе препарата для генной терапии ишемических заболеваний. В настоящее время на рынке или в клинических исследованиях препаратов, основанных на бицистрон-ных плазмидных векторах, не имеется, что делает дальнейшую разработку препарата актуальной.