Ispol'zovanie tekhnologii CRISPR/CAS9 dlya vyklyucheniya ekspressii gena urokinaznogo retseptora v neyroblastome

Abstract

Full Text

Компоненты урокиназной системы - активатор плазминогена урокиназного типа (uPA), урокиназный рецептор (uPAR) и ингибиторы PAI-1 и PAI-2 - участвуют в формировании и регенерации сосудов и нервов. Сериновая протеаза uPA стимулирует миграцию эндотелиальных клеток и рост аксонов по Гены & Клетки Том XII, № 3, 2017 220 материалы III национального конгресса по регенеративной медицине средством двух взаимодополняющих механизмов. Во-первых, uPA расщепляет белки внеклеточного матрикса, высвобождая про-ангиогенные и нейротроф-ные факторы (фактор роста фибробластов bFGF, сосудисто-эндотелиальный фактор роста VEGF, мозговой нейротрофический фактор BDNF). Во-вторых, связываясь с uPAR на поверхности клеток, uPA запускает внутриклеточную сигнализацию с участием киназы фокальных контактов FAK, Ras/MAPK сигнального пути, киназы Akt, a также JAK/STAT сигнализации, приводящей к изменению в экспрессии генов, ответственных за пролиферацию, миграцию и дифференцировку клеток. uPA и uPAR вовлечены в процессы, связанные с ростом и инвазией опухоли, а также васкуляризацией первичного опухолевого узла. Антитела, специфичные к uPAR, полностью блокируют инвазию клеток глиомы U251 в тестах in vitro. Эти и другие результаты по блокированию и/или снижению экспрессии uPAR в опухолевых клетках легли в основу разработки перспективных подходов для ингибирования uPA/uPAR-зависимых путей опухолевого роста и метастазирования. Задачей данного исследования было создать подход для нокаутирования гена uPAR с помощью технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 в клетках нейробластомы Neuro2a и далее оценить их пролиферацию и активацию сигнального пути с участием митоген-активируемой киназы Akt. Клетки Neuro2a имеют полиплоидное ядро и содержат от 59 до 193 хромосом, поэтому для эффективного выключения экспрессии гена uPAR проводили три последовательные трансфекции плазмидами, содержащие ги-довые РНК к гену uPAR, эндонуклеазу Cas9 и ген зелёного флуоресцентного белка EGFP. После каждого цикла трансфекции отбирали EGFP-позитивные субпопуляции, в которых далее оценивали экспрессию гена uPAR методами (1) ПЦР в режиме реального времени, (2) иммунофлуоресцентного окрашивания и (3) методом проточной цитометрии с помощью специфичных к uPAR антител. После третьей трансфекции было получено 30 клонов, у 10 из которых содержание белка uPAR было снижено, а в 2 клонах полностью отсутствовало по сравнению с исходным уровнем uPAR. Дальнейший анализ клеток с полным отсутствием экспрессии uPAR показал максимальное снижение пролиферации Neuro2a по сравнению с контрольными клетками с нативной экспрессией uPAR. При этом подавление пролиферации Neuro2a сопровождалось почти полным снижением уровня фосфорилирования киназы Akt (по Thr308), активация которого в клетках важна для поддержания их пролиферации и выживаемости. Таким образом, мы обнаружили, что выключение экспрессии uPAR с помощью CRISPR/Cas9 технологии в клетках нейробла-стомы представляет собой перспективную стратегию для изучения процессов онкогенеза, а также может служить в качестве терапевтического подхода для подавления пролиферации опухолевых клеток.