Izmenenie sekretoma mononuklearnykh kletok krovi pupoviny cheloveka na fone ikh geneticheskoy modifikatsii

Abstract

Full Text

В последнее десятилетие показано, что монону-клеарные клетки крови пуповины (МККП) человека могут быть использованы при терапии широкого круга заболеваний. При этом известно, что МККП человека представляют собой неоднородную гетерогенную популяцию клеток, включающую в себя лимфоциты, моноциты, стволовые клетки и ряд других клеточных типов. МККП человека способны дифференцироваться в различные клеточные типы, а также секретировать широкий диапазон ростовых и трофических факторов. Согласно последним данным, именно факторы, секретируемые трансплантируемыми клетками обуславливают их терапевтическое воздействие за счет различных паракринных эффектов и активации естественных механизмов регенерации тканей. Кроме того, остается возможность in vitro дифференцировки трансплантируемых МККП в различные клетки организма за счет эффектов окружения и внутреннего клеточного потенциала. С целью повышения терапевтического эффекта трансплантируемых клеток предлагается их генетическая модификация различными генно-терапевтическими конструкциями. В данной работе мы прово Гены & Клетки Том XII, № 3, 2017 214 материалы III национального конгресса по регенеративной медицине дили оценку влияния трансдукции рекомбинантными аденовирусами на секрецию МККП человека цито-кинов, хемокинов и факторов роста. С помощью градиентного центрифугирования из пуповинной крови человека были выделаны мононуклеарные клетки. Проведена трансдукция МККП человека аденовирусами, экспрессирующими ген сосудистого эндотелиального фактора роста человека (Ad5-VEGF) или усиленного зеленого флуоресцентного белка (Ad5-EGFP). Валидацию биосинтеза мРНК рекомбинантных генов VEGF и EGFP модифицированными МККП человека проводили с использованием ген специфических праймеров и проб TaqMan®. Анализ содержания 48 аналитов в кондиционной среде, собранной с генетически модифицированных клеток, осуществляли с применением наборов Bio-PlexPro™ HumanCytokine 21- и 27-plexAssay (BioRad) по технологии Luminex®xMAP. В ходе количественной ПЦР было установлено, что МККП, трансдуцированные Ad5-VEGF или Ad5-EGFP, повышают уровень экспрессии целевых генов в 1600 (VEGF) и 1000 (EGFP) раз, по сравнению с контролем (нативные клетки). При оценке секретомного профиля МККП было выявлено, что нативные клетки и клетки, трансдуцированные Ad-EGFP, имеют схожий профиль секреции анализируемых факторов. Клетки секретировали: IL-1b, IL-1ra, IL-2, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, Eotaxin, FGF-2, G-CSF,GM-CSF, IFN-g, IP-10, MCP-1, MIP-1a, PDGF-bb, MIP-1b, RANTES, TNF-a, VEGF, IL-1a, IL-2Ra, IL-3, IL-12p40, IL-16, IL-18, CTACK, GROa, HGF, IFN-a2, LIF, MCP-3, M-CSF, MIF, MIG, b-NGF, SCF, SCGF-b, SDF-1a, TNF-b, TRAIL. В то же время, как и ожидалось, клетки, трансдцуированные Ad-VEGF, имели повышенный уровень секреции VEGF, а также IL-8, IL-12, FGF-2, GM-CSF, IP-10, IL-2Ra, IL-3, IL-16, IL-18, CTACK, GROa, IFN-a2, LIF, MCP-3, MIF, b-NGF, TRAIL по сравнению с контролями. Таким образом, мы предполагаем, что используя различные гены и их комбинации можно целенаправленно модулировать секретомный профиль клеток, задавая им необходимый терапевтический потенциал.